基于骨組織Runx2、Osterix啟動(dòng)子甲基化探究鹿茸中藥復(fù)方對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效機(jī)制＊

王 劍，李 屹，王 實(shí)，劉劍輝，劉文艷，宋光熠，鄭洪新

（1. 遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 沈陽 110101；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 沈陽 110847）

隨著人口老齡化加速，全球每3 秒就會(huì)發(fā)生1 例骨質(zhì)疏松性骨折。 其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）發(fā)病率逐步上升，嚴(yán)重影響絕經(jīng)后婦女的生活質(zhì)量。

骨質(zhì)疏松癥是多種原因引起的以全身骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降，骨脆性增加為特征的一種代謝性骨病，極易發(fā)生骨折。近年研究表明，DNA 甲基化、組蛋白修飾、microRNA 可調(diào)控多種成骨、破骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和活性，參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[1]。本研究基于成骨細(xì)胞分化、成熟的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix[2]基因啟動(dòng)子的甲基化修飾，探究我國醫(yī)學(xué)“腎主骨”理論指導(dǎo)下的鹿茸中藥復(fù)方防治PMOP的表觀遺傳療效機(jī)理，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組、造模

SPF級Wistar3月齡雌性未交配大鼠61只，體質(zhì)量（240 ± 20）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司（遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心），許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。動(dòng)物購進(jìn)后，飼養(yǎng)于遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理實(shí)驗(yàn)室（國家中醫(yī)藥管理局二級實(shí)驗(yàn)室），室溫20℃～25℃，相對濕度35%～65%，飼喂大小鼠維持飼料（遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司）。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4 天后，隨機(jī)分出正常組12 只，余者進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)：3%戊巴比妥鈉腹腔注射（35 mg/kg）麻醉，腹部切口切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后大鼠隨機(jī)分出模型組12 只、鹿茸中藥復(fù)方組18 只、仙靈骨葆陽性對照組19只（灌胃期間死亡1只）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及給藥劑量與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥品

鹿茸中藥復(fù)方：排血馬鹿茸凍干粉（遼寧宏宇生物科技有限公司）、淫羊藿顆粒（規(guī)格：100 g 顆粒相當(dāng)于2100 g 飲片，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司）、納米牡蠣殼微粉（平均粒徑780 nm，長山島大連灣）。

仙靈骨葆膠囊：成分為淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃，國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025337，批號(hào)180417。

1.2.2 給藥劑量與方法

大鼠等效劑量按成人（體質(zhì)量60 kg）6.3 倍計(jì)算，1 ml/100 g。正常組和模型組給生理鹽水；鹿茸中藥復(fù)方組給鹿茸中藥復(fù)方（排血馬鹿茸凍干粉0.315 g·kg-1·d-1、淫羊藿顆粒0.15 g·kg-1·d-1、納米牡蠣殼微粉1.05 g·kg-1·d-1）；仙靈骨葆陽性對照組給仙靈骨葆膠囊粉0.315 g·kg-1·d-1。術(shù)后6 d開始，每日灌胃1次（每灌6日，休息1日），連續(xù)14周。

1.3 主要儀器與試劑

1.3.1 主要儀器

X 射線骨密度測定儀（STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法國）、PCR 儀（96 孔，BIORAD）、S1000TM Thermal Cycler （384 孔 ，BIORAD） 、MassARRAY Nanodispenser（RS1000，SEQUENOM）等。

1.3.2 主要試劑

QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，51304）、EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO，D5005）、MassCLEAVE Kit（SEQUENOM，10129.1）、PCR Accessory Set（SEQUENOM，11327）、Spectro CHIP ? Arrays and Clean Resin Kit（SEQUENOM，10117）等。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 骨密度（BMD）

取第1～6 腰椎，剔除附著軟組織，生理鹽水沖洗，用生理鹽水浸濕的醫(yī)用紗布包裹，外包錫紙，寫上編號(hào)，凍存于-80℃冰箱。應(yīng)用X 線骨密度儀（STRATOS DR）檢測大鼠第1～6腰椎骨密度，精細(xì)模式掃描，儀器附帶DMS 小動(dòng)物軟件（版本：V4.0.7.1）分析骨密度值，以單位面積骨礦含量（g/cm2）表示。

1.4.2 Runx2、Osterix啟動(dòng)子甲基化水平

取雙側(cè)股骨頭，剔除附著軟組織，生理鹽水沖凈血污，無菌吸水紙吸干，裝入編好號(hào)的液氮凍存管，擰緊管蓋，液氮速凍0.5 h后，凍存于-80℃冰箱。質(zhì)譜法檢測：①引物設(shè)計(jì)：檢測片段：Runx2 基因啟動(dòng)子-955 bp～-456 bp（序 列：CTTCAAAGTAACCAAGGGATGATGGTAAAAATAATATAAATGATACTAATTACAT TTAATCTTTATTGTAAGAGCTACCACCTAATAAAAA AATCAACTACACAGTCATGATTTAGTATTTGTAAAG GAATCCCCAGGCTAACACTTTTGTGACAGCCAATTA CAGTCAATCCCGGCAAGGAGTTTGCAAGCAGACCTT TGGAAAGGTAAACTGTTTTACAATGAGTTACAGATC TACAAGCTTAGGAAGACAAGCAGGAAAGAAGCAGC CACCCTGGGAAATCCGAAGCAGCCCTGAAAGTGAT ACAATCCCAAGATGTGACCCACTGCGAAGCAGCAGT TGTTCAGAACGCCGCACTCACTTGAAACAGTTTTGC TCACTTTTCCATAGACATAATAATGAAGGAAAGAGA GGAGGGGTAGAGAAAAGAGAAGAAAGAGCAGACG AGGGAAGGAGGGAAGGGGGGAGTAGGGAGGTGG ?TAGAAAGGAAAACCCTTAGC），長度500 bp，CpG 位點(diǎn)總數(shù)6 個(gè)，能檢測到5 個(gè)CpG 位點(diǎn)。Osterix 基因啟動(dòng) 子-1082 bp～-583 bp（序 列：AGGACCCAC

TGTAGATGGAGGGAACTGACTTCTTTATGTCTTTCTC AGCTCTCCAAATTTGTGCCATGGCATGGGTTCACTG ATCACCCATTCCAATCTCTAGATAGATTCAACTAAA AATTTTAATTTAGATTTTAGTTTGACTAATATAGGGA CATAGTGACTAGTAATGTGTGATAGACTTTAAGAGA TTAACAAGACATTTAGCTACTAATTTAATTTCCAGG GACTCCATCCTTGGATACCTGCAAGTGTCAATGACC TCAGTTTACTTTCTAGTTTTCCAATCTAATGCGGGAT GGAGTTACTCTAAGAATCCATTATTAGAAGGAATTC TACCTTCTCTATAAACTTTTGGGCATGACCTAGTCAA AGTTTTTGGTAAATGGTTTACTCCCACGGTTTCTAGA GCCAATATCAGAAAGAGTCCTGAAGGCTGATCAAGT ACCTCTGGAAAATATTTCCAAAGGGTACGTGCATCT?GTTTTCTGGTCCTGGCTC），長度500 bp，CpG 位點(diǎn)總數(shù)3 個(gè)，均可檢測到。使用Sequenom 公司Epidesigner（http://www.epidesigner.com）設(shè)計(jì)引物，Runx2 修飾后的上游引物：aggaagagagTTTTAAAGTAATTAAGGGAT?GATGG，修飾后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggaga?aggctACTAAAAATTTTCCTTTCTACCACCTC。 Osterix

修飾后的上游引物：aggaagagagTGGTAGGTGGTAGTG?TAGGTGTTTT，修飾后的下游引物：cagtaatacgactcac?tatagggagaaggctAAAAAAAATCTTCTC-CTCTCTCAAA。引物設(shè)計(jì)完成后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。②DNA 提?。菏褂肣IAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）試劑盒提取骨組織DNA。③重亞硫酸鹽處理：使用PCR 儀（96 孔，BIORAD）、EZ DNA Methyla?tion-Gold Kit（ZYMO）試劑盒對DNA 樣品進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的C 轉(zhuǎn)變?yōu)閁，甲基化的C 不變。④PCR 擴(kuò)增：使用S1000TM Thermal Cycler（384孔，BIORAD）、PCR Accessory Set（SEQUENOM）試劑盒和步驟①設(shè)計(jì)、修飾、合成的引物擴(kuò)增重亞硫酸鹽處理后的樣品。⑤堿性磷酸酶處理（SAP）：使用S1000TM Thermal Cycler（384 孔，BIORAD）、Mass?CLEAVE Kit（SEQUENOM）試劑盒處理步驟④的PCR產(chǎn)物。⑥體外轉(zhuǎn)錄(IVT)和RNase 酶切：使用S1000TM Thermal Cycler（384 孔，BIORAD）、MassCLEAVE Kit（SEQUENOM）試劑盒將SAP 處理后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和RNase 酶切。⑦純化，點(diǎn)樣及質(zhì)譜：使用

Spectro CHIP ? Arrays and Clean Resin Kit（SEQUE?NOM）試劑盒。本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜法檢測甲基化由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組計(jì)量資料數(shù)據(jù)兩兩組間比較用one-way ANOVA，P＜0.05為差異顯著。

表1 各組大鼠離體第1～6腰椎骨密度（-x ± s）

2 結(jié)果

2.1 各組第1～6腰椎骨密度比較

由表1 可知，與正常組比較，模型組第1～6 腰椎骨密度明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組、仙靈骨葆陽性對照組第1～6 腰椎骨密度明顯升高（P＜0.05）；鹿茸中藥復(fù)方組比仙靈骨葆陽性對照組第1～6 腰椎骨密度有升高趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 各組骨組織Runx2、Osterix啟動(dòng)子甲基化水平比較

Runx2 基因啟動(dòng)子檢測片段-955 bp～-456 bp 含有CpG 位點(diǎn)6 個(gè)，位點(diǎn)6 未檢測到；Osterix 基因啟動(dòng)子檢測片段-1082 bp～-583 bp 含有CpG 位點(diǎn)3 個(gè)，均檢測到。

2.2.1 各組骨組織Runx2 啟動(dòng)子-955 bp~-456 bp 甲基化水平比較

由表2 可知，與正常組比較，模型組CpG1、CpG2甲基化水平明顯升高（P＜0.05），模型組CpG3、CpG4.5甲基化水平有升高趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組CpG1、CpG3甲基化水平明顯降低（P＜0.05），鹿茸中藥復(fù)方組CpG2、CpG4.5甲基化水平有降低趨勢，差異不顯著（P＞0.05）；仙靈骨葆陽性對照組CpG1、CpG2 甲基化水平明顯降低（P＜0.05），仙靈骨葆陽性對照組CpG3、CpG4.5 甲基化水平有降低趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 各組骨組織Osterix 啟動(dòng)子-1082 bp~-583 bp 甲基化水平比較

由表3 可知，與正常組比較，模型組CpG1、CpG2甲基化水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組CpG1 甲基化水平明顯降低（P＜0.05），鹿茸中藥復(fù)方組CpG2 甲基化水平有降低趨勢，差異不顯著（P＞0.05）；仙靈骨葆陽性對照組CpG1、CpG2甲基化水平明顯降低（P＜0.01），仙靈骨葆陽性對照組CpG3 甲基化水平有降低趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。

表2 各組大鼠骨組織Runx2基因啟動(dòng)子-955 bp～-456 bp甲基化水平（± s）

表2 各組大鼠骨組織Runx2基因啟動(dòng)子-955 bp～-456 bp甲基化水平（± s）

注：與正常組比較：*P ＜0.05；與模型組比較：△P ＜0.05

CpG4.5 0.3800±0.0228 0.3900±0.0604 0.3567±0.0497 0.3633±0.0281組別正常組模型組鹿茸中藥復(fù)方組仙靈骨葆陽性對照組n 6 5 6 6 CpG1 0.3500±0.1058 0.4960±0.1187*0.3617±0.0496△0.3883±0.0440△CpG2 0.5233±0.1249 0.7240±0.0833*0.5783±0.0646 0.4917±0.2472△CpG3 0.5517±0.0708 0.6000±0.0300 0.5400±0.0400△0.5433±0.0333

表3 各組大鼠骨組織Osterix基因啟動(dòng)子-1082 bp～-583 bp甲基化水平（± s）

注：與正常組比較：**P ＜0.01；與模型組比較：△P ＜0.05，△△P ＜0.01

CpG3 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 0.9783±0.0531組別正常組模型組鹿茸中藥復(fù)方組仙靈骨葆陽性對照組n 6 5 6 6 CpG1 0.8483±0.0621 0.9820±0.0217**0.9333±0.0137△0.9000±0.0141△△CpG2 0.7500±0.0210 0.8360±0.0398**0.7850±0.0609 0.7033±0.0388△△

3 討論

本課題組主要研究去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞分化、成熟的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix[2]基因啟動(dòng)子的甲基化修飾，旨在從表觀遺傳學(xué)揭示成骨關(guān)鍵基因Runx2、Osterix 的甲基化修飾與PMOP 發(fā)病的關(guān)聯(lián)以及中醫(yī)學(xué)“腎主骨”理論指導(dǎo)下的鹿茸中藥復(fù)方的療效機(jī)理。

表觀遺傳修飾研究的是基因序列不改變，通過DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 和microRNA、染色質(zhì)重塑等，產(chǎn)生可遺傳的基因表達(dá)改變，是重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制之一。DNA 甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶催化，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上，胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶，是可逆的DNA 自然化學(xué)修飾方式，可隨DNA 復(fù)制而遺傳，在基因沉默、細(xì)胞分化、腫瘤和衰老等過程中發(fā)揮重要作用[3]。目前人們認(rèn)為DNA 甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的可能機(jī)制有兩個(gè)：①啟動(dòng)子序列甲基化DNA 與甲基化胞嘧啶結(jié)合蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)染色質(zhì)組蛋白脫乙?；瑯?gòu)象改變，抑制基因轉(zhuǎn)錄[4]。②甲基化基團(tuán)可阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控序列結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄[3]。近年研究表明DNA 能主動(dòng)去甲基化[5]，啟動(dòng)、活化基因轉(zhuǎn)錄[3]。

Runx2、Osterix 是成骨細(xì)胞分化、成熟的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子[2]，調(diào)控骨鈣素、骨橋素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原等多種重要成骨細(xì)胞表型基因的表達(dá)[6-7]，促進(jìn)骨形成，對防治骨質(zhì)疏松有重大意義。有研究顯示，補(bǔ)腎中藥通過上調(diào)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)Runx2、Osterix，提高大鼠骨量[8-9]。張?zhí)黻坏萚10]研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸、右歸丸可提高去卵巢大鼠股骨骨髓Runx2 mRNA 及蛋白表達(dá)。本課題組前期研究顯示，去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Runx2 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯降低，補(bǔ)腎益髓中藥復(fù)方可上調(diào)之，有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[11]；糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Osterix mRNA 及蛋白表達(dá)明顯降低，補(bǔ)腎中藥可上調(diào)之，有效防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥[12]。

Roforth等[13]評估青年及老年女性間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞DNA甲基化水平，結(jié)果表明某些基因的甲基化水平可能與年齡相關(guān)的骨形成減弱導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥相關(guān)。DNA 甲基化對成骨關(guān)鍵基因Runx2、Osterix 表達(dá)的影響目前存在爭議。朱筱等[3]研究表明，降低Runx2 啟動(dòng)子甲基化水平，活化其轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其表達(dá)。Liu H 等[14]研究表明，在成骨細(xì)胞祖細(xì)胞中，上調(diào)Runx2 和Osterix 甲基化，導(dǎo)致骨形成減少。Sepulveda H 等[15]研究表明，抑制DNA 甲基化會(huì)引起組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑改變，導(dǎo)致Sp7（Osterix）基因的表達(dá)。Zhang D 等[16]研究表明，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑上調(diào)Runx2、Osterix 表達(dá)。Zhang R P 等[17]研究表明，在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化模型中，Runx2、Osterix 等成骨特異基因啟動(dòng)子CpG 位點(diǎn)去甲基化伴隨著成骨分化過程中其基因表達(dá)的增加。楊鋒等[18]研究表明，左歸丸含藥血清通過降低Runx2、Osterix 基因甲基化促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。但是，F(xiàn)arshdousti Hagh M等[2]研究表明，在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，Runx2 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)沒有改變，而Osterix 啟動(dòng)子甲基化模式呈動(dòng)態(tài)變化，Osterix 的表觀遺傳調(diào)控可能起主導(dǎo)作用。Li Z 等[19]研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，Runx2 表達(dá)上調(diào)，但與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化無關(guān)。

那么，骨質(zhì)疏松是否與成骨關(guān)鍵基因Runx2、Osterix 甲基化修飾的表觀遺傳失調(diào)有關(guān)？本研究采取切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的經(jīng)典方法復(fù)制PMOP動(dòng)物模型[20]，基于骨組織Runx2、Osterix 啟動(dòng)子甲基化水平，探究PMOP 發(fā)病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制以及鄭洪新教授在中醫(yī)學(xué)“腎藏精生髓主骨”理論指導(dǎo)下并經(jīng)多年科研、臨床實(shí)踐證明可有效防治PMOP 的鹿茸中藥復(fù)方（君藥鹿茸：補(bǔ)腎助陽、生精益血、強(qiáng)筋健骨，以君藥擬定方名；臣藥淫羊藿：溫腎壯陽、強(qiáng)筋骨；佐藥牡蠣：補(bǔ)腎、強(qiáng)骨節(jié)、潛陽補(bǔ)陰，全方共奏益腎填精、生髓壯骨之功）的療效機(jī)理，陽性對照藥選擇國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司的仙靈骨葆膠囊（成份：淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃；功效：滋補(bǔ)肝腎、接骨續(xù)筋、強(qiáng)身健骨）。結(jié)果顯示：模型組第1～6 腰椎骨密度比正常組明顯降低，這說明PMOP 模型復(fù)制成功；鹿茸中藥復(fù)方組、仙靈骨葆陽性對照組第1～6腰椎骨密度均比模型組明顯升高，這說明本研究鹿茸中藥復(fù)方和仙靈骨葆可有效防治PMOP。模型組骨組織Runx2 啟動(dòng)子-955 bp～-456 bp CpG1、CpG2 和Osterix啟動(dòng)子-1082 bp～-583 bp CpG1、CpG2 甲基化水平比正常組明顯升高，提示去卵巢造成骨組織Runx2、Osterix 啟動(dòng)子高甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)其靶基因骨鈣素、骨橋素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原等成骨細(xì)胞表型基因的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞分化和成骨，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。鹿茸中藥復(fù)方和仙靈骨葆均可降低去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx2、Osterix 啟動(dòng)子甲基化水平，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)其靶基因骨鈣素、骨橋素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原等基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成骨，有效防治PMOP。

本課題組的研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制之一可能是骨組織Runx2、Osterix 啟動(dòng)子甲基化水平升高；鹿茸中藥復(fù)方可能通過降低骨組織Runx2、Osterix 啟動(dòng)子甲基化水平，有效防治該病。本研究為闡明PMOP的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)新的途徑，并為臨床探索PMOP 的防治及療效機(jī)理提供了新的靶點(diǎn)。