糖耐康對db/db小鼠肝臟p38MAPK/NF-κBp65信號通路的影響＊

王明慧，吳麗麗，秦靈靈，吳 悠，劉 瑋，田 芃，宋紫臨，張程斐，劉銅華**

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 咸陽 71200；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100029 ；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029 ；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100029）

2 型糖尿病是機(jī)體內(nèi)胰島素分泌不足或胰島素抵抗，以糖脂代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌疾病。非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是糖尿病最常見的并發(fā)癥，其在發(fā)展過程可能從非酒精性單純性脂肪肝演變成非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及相關(guān)肝硬化和肝癌，普通成人NAFLD患病率為6.3%-45%，嚴(yán)重地威脅人類的健康[1-2]。目前，NAFLD 已經(jīng)成為引起肝臟疾病的首位原因，并呈大眾化、低齡化趨勢，早期治療及診斷有著重要意義。中醫(yī)藥在NAFLD治療方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，特別是對NAFLD 取得了較好的臨床療效。糖耐康是導(dǎo)師劉銅華教授結(jié)合中醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理學(xué)研究治療2型糖尿病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，課題前期研究[3]表明，糖耐康可調(diào)節(jié)小鼠糖脂代謝紊亂、降低炎癥因子（TNF-α、IL-6、CRP）的表達(dá)水平而改善整體和局部代謝性炎癥反應(yīng)。本研究以db/db 小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，基于p38MAPK/NFκBp65 信號通路，探討糖耐康對db/db 小鼠脂肪肝的影響。

1 材料

1.1 動物

BKS.Cg-m+/+Leprdbrdb/J（db/db）小 鼠16 只 和Dock7m+/+Leprdb（db/m+）小鼠8 只，雄性，6-8 周齡，購自南京大學(xué)模式動物研究所，合格證號SCXK（蘇）：2015-0001。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，室溫（24±2）℃左右，空氣濕度40%左右，每日12 h光照維持。動物自由飲水，以正常維持飼料喂養(yǎng)，飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房提供。動物實(shí)驗(yàn)通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：BUCM-4-2018080101-3030）。

1.2 藥物與試劑

血糖試紙（愛科來國際貿(mào)易有限公司，批號：K183D36）；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：NO.20190327）；ELISA 試劑盒TNF-α、IL-6、IL-1β（北京索萊寶科技有限公司，批號：NO.20190701）；p-p38 MAPK 抗體、p38 MAPK 抗體、NF-κBp65 抗體、β-actin抗體（CST 公司）、30%聚丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）、胞核胞漿胞膜制備試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。糖耐康顆粒（3 g/袋，由夏枯草、女貞子、番石榴葉、三白草和人參組成，四川美大康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）。

1.3 儀器

離心機(jī)（美國SIGMA 公司，型號：3K15）；酶標(biāo)儀（美國Promega 公司，型號：E9032）；快速血糖儀（愛科來國際貿(mào)易上海有限公司，型號：GT-1941）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號：IX71 型）；垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司，型號：Mini-PROTEAN Tera System）；凝膠成像儀（美國BIO-RAD 公司，型號：ChemiDocTM XRE with Image LabTM Software）。

2 方法

2.1 分組與給藥

6-8 周齡db/db 小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，連續(xù)兩日早上8:00 進(jìn)行尾靜脈血血糖監(jiān)測，尾靜脈隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L，則選入實(shí)驗(yàn)組。按血糖及體重，隨機(jī)將16 只db/db 小鼠分為2 組：糖耐康組（3.24 g/kg）、模型組（灌胃等體積超純水）及另設(shè)同周齡的8 只db/m+小鼠作為正常組（灌胃等體積超純水），每組8 只。根據(jù)給藥量配比合適濃度后，按照5 mL/kg 體重灌胃，正常組和模型組按照相同給藥系數(shù)進(jìn)行超純水灌胃，每日下午同時間段給藥一次，連續(xù)給藥干預(yù)8周。

2.2 取材

第8 周，末次給藥后禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，靜置3 小時后3000 r/min，10 min 離心分離血清，-20℃保存；取小鼠肝臟組織，多聚甲醛固定，其余組織-80℃凍存。

2.3 檢測指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 血清指標(biāo)

空腹血糖由血糖儀及配套試紙測定，全自動生化儀測定血脂四項（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及FFA、肝功兩項（ALT、AST），嚴(yán)格按照說明書步驟測定。

2.3.2 肝臟組織勻漿及相關(guān)指標(biāo)測定

2.3.2.1 肝臟組織勻漿制備從-80℃冰箱取肝臟組織，剪切成細(xì)小的碎片，每20 mg組織加入200 μL裂解液、2 μL蛋白酶抑制劑和2 μL磷酸酶抑制劑，冰水浴制備均漿后的樣品12000 g離心5分鐘，取上清液待測。使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，凍存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2.2 Elisa 法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β 炎癥因子的含量取肝組織勻漿上清，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中并按說明書加入相應(yīng)試劑，37℃孵育90 min。拍板、洗板4 次，加入酶標(biāo)試劑，37℃孵育60 min。洗板、拍板5 次，加入顯色液，37℃顯色避光15 min。加入終止液，5 min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取OD值并處理數(shù)據(jù)。

2.3.3 病理學(xué)檢測

包埋：肝臟組織置于4%組織固定液內(nèi)固定，梯度乙醇溶液脫水，石蠟包埋。

染色和封片：二甲苯脫蠟、100%、90%、80%、70%梯度乙醇脫水，蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學(xué)的變化。

2.3.4 蛋白免疫印跡檢測

從-80℃冰箱取50 mg 左右小鼠肝臟組織，置于冰上剪碎，加入含有裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑及研磨鋼珠的2 mL EP 管中，使用研磨機(jī)研磨后，冰上靜置30 min，離心4℃，12000 rpm，15 min，吸取上清，獲得總蛋白樣品。上清液和上樣緩沖液混勻煮沸制備成蛋白電泳樣品。①電泳：上樣每孔加20 μL，10 min 90v 濃縮膠，60 min 100v 分離膠。②轉(zhuǎn)膜：預(yù)處理好的海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿依次順序做成三明治樣裝好，100v 濕轉(zhuǎn)60 min。③封閉：Blocking one/Blocking one-P 封閉60 min。④加一抗、二抗：一抗根據(jù)說明書按1：1000 比例稀釋，4℃孵育過夜，TBS（Tris緩沖液）洗膜后二抗（1∶1000）37℃搖床孵育1 h。⑤洗膜后加ECL發(fā)光液，室溫反應(yīng)2 min，凝膠成像儀成像，使用Image J 軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 20 進(jìn)行分析統(tǒng)計，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法。P＜0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01 表示結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

表1 對db/db小鼠體質(zhì)量的影響/g（n=8，± s）

表1 對db/db小鼠體質(zhì)量的影響/g（n=8，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

第8周24.28±1.03 48.60±2.72＊＊46.53±2.60組別正常組模型組糖耐康組第1周21.24±0.80 38.52±1.18＊＊37.78±1.52第4周24.03±0.76 45.16±1.96＊＊44.04±1.83

表2 對db/db小鼠肝重的影響/g（n=8，± s）

表2 對db/db小鼠肝重的影響/g（n=8，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

肝臟指數(shù)0.055±0.0006 0.065±0.0022＊＊0.05±0.0015＃＃組別正常組模型組糖耐康組肝重1.34±0.04 3.15±0.15＊＊2.19±0.18＃＃

3 結(jié)果

3.1 糖耐康對db/db小鼠一般情況的影響

正常組db/m+小鼠精神良好，活動自如，皮毛光澤。與正常組相比，db/db 小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛色欠佳、少動貪吃等現(xiàn)象。與模型組比較，糖耐康組體重下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義；糖耐康組肝臟指數(shù)顯著下降（P＜0.01）（見表1、表2）。

3.2 糖耐康對db/db小鼠糖脂代謝影響

與正常組比較，模型組空腹血糖、ALT、AST、TG、TC 和FFA 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，糖耐康組空腹血糖、ALT、AST、TG、TC 和FFA 的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）（見表3、表4、表5）。

3.3 糖耐康對db/db小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，正常組小鼠肝細(xì)胞大小、形態(tài)均勻正常，細(xì)胞核居中，胞質(zhì)豐富，以中央靜脈為中心，肝小葉排列整齊；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞體積明顯增大、排列混亂，胞質(zhì)可見大小不等的脂肪空泡，將細(xì)胞核擠向一邊，有炎癥細(xì)胞浸潤，可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性。與模型組相比，糖耐康組肝臟病理表現(xiàn)以輕度至中度脂肪變?yōu)橹?，肝?xì)胞形態(tài)大致正常，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡減少，炎癥細(xì)胞浸潤減少（見圖1）。

表3 空腹血糖水平/mmol·L-1（n=8，± s）

表3 空腹血糖水平/mmol·L-1（n=8，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

第8周5.04±0.98 32.89±2.88＊＊26.13±2.38＃組別正常組模型組糖耐康組第1周4.09±0.13 22.26±2.07＊＊21.5±2.21第4周4.06±0.51 27.30±1.41＊＊22.43±1.67＃

表4 對db/db小鼠血清ALT、AST水平的影響/mmol·L-1（n=8，± s）

表4 對db/db小鼠血清ALT、AST水平的影響/mmol·L-1（n=8，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

AST 121.78±10.69 189.13±14.51＊＊144.33±18.26＃＃組別正常組模型組糖耐康組ALT 36.81±4.80 86.80±8.00＊＊58.78±7.62＃＃

3.4 糖耐康對db/db小鼠肝臟組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平的影響

與正常組比較，模型組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，糖耐康組小鼠肝臟組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）（見表6）。

3.5 糖耐康對db/db 小鼠肝臟組織p-p38MAPK、NFκBp65蛋白表達(dá)水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織p-p38 MAPK、核NF-κBp65蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，糖耐康組小鼠肝臟組織p-p38MAPK、核NF-κBp65 蛋白表達(dá)量顯著下降，總p38MAPK 的蛋白水平?jīng)]有變化（P＜0.05或P＜0.01）（見表7、圖2）。

4 討論

非酒精性脂肪肝是以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和肝小葉內(nèi)炎癥為特征的一類疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與炎性細(xì)胞因子分泌、脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗密切相關(guān)[4-5]。其中，肝組織炎癥反應(yīng)是NAFLD 的重要致病機(jī)制之一[6-7]。P38 絲裂原活化蛋白激酶是MAPK 家族一員，是真核生物細(xì)胞內(nèi)的一類絲裂酶原激活的蛋白酶原，可受多種細(xì)胞外刺激而磷酸化激活，并參與炎癥反應(yīng)。p38MAPK 蛋白磷酸化，調(diào)控下游因子，促使效應(yīng)細(xì)胞生成并釋放TNF-α、IL-6 等多種炎性因子，造成肝細(xì)胞損傷[8-9]。TNF-α、IL-6 增強(qiáng)肝臟局部炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生。NF-κB 是一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，其中p65 蛋白作為NF-кB 通路蛋白家族的重要組成，其參與慢性炎癥的調(diào)節(jié)過程。NF-κB能促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性以及TNF-α、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的增加，從而引起脂肪性肝損傷。因此抗炎將有利于NAFLD的治療[10]。

表5 血脂及FFA水平/mmol·L-1（n=8，± s）

表5 血脂及FFA水平/mmol·L-1（n=8，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

FFA 0.92±0.12 2.92±0.22＊＊2.2±0.28＃組別正常組模型組糖耐康組TC 2.24±0.14 3.91±0.15＊＊3.27±0.25＃＃TG 0.7±0.07 2.22±0.26＊＊1.28±0.17＃＃LDL 0.44±0.08 0.52±0.10 0.48±0.06 HDL 2.14±0.14 2.33±0.29 2.28±0.14

圖1 小鼠肝組織石蠟切片HE染色光鏡觀察結(jié)果（X200）

表6 肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達(dá)水平/pg·mL-1（n=6，± s）

表6 肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達(dá)水平/pg·mL-1（n=6，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

IL-1β 150.85±27.75 782.55±61.67＊＊469.67±25.25＃＃組別正常組模型組糖耐康組TNF-α 104.12±17.40 565.79±25.00＊＊323.37±22.11＃＃IL-6 62.44±10.58 254.69±32.6＊＊176.24±18.2＃＃

表7 p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表達(dá)結(jié)果（n=6，± s）

表7 p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表達(dá)結(jié)果（n=6，± s）

注：與正常組相比，＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01

NF-κBp65/β-actin 0.19±0.03 1.16±0.12＊＊0.7±0.03＃＃組別正常組模型組糖耐康組p-p38MAPK/p38MAPK 0.55±0.03 1.05±0.05＊＊0.65±0.02＃＃

圖2 小鼠肝組織p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表達(dá)情況

非酒精性脂肪肝據(jù)臨床癥狀可歸屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”“痰濁”“肥氣”等范疇，其發(fā)病機(jī)制為本虛標(biāo)實(shí)，肝脾虧虛，痰濕內(nèi)阻。中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪肝具有很大的優(yōu)勢，糖耐康是導(dǎo)師劉銅華教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，糖耐康以夏枯草為君藥，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱瀉火，散結(jié)消腫的功效；臣藥番石榴葉有清熱解毒、燥濕健脾的功效，三白草有清熱解毒、利尿消腫的功效；佐藥是人參、女貞子滋補(bǔ)肝腎的功效。故糖耐康燥濕祛痰，滋補(bǔ)肝脾，標(biāo)本兼顧，在非酒精性脂肪肝的臨床治療中療效顯著。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，組方中單味藥夏枯草中迷迭香酸能降低炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、CCL20 和TNF-α 的表達(dá)，下調(diào)NF-κB信號通路，具有一定抗炎作用[11]。番石榴葉具有抗炎、抗氧化、降血糖和血脂等多種藥理活性[12]。三白草所含的金絲桃苷、三白脂素-8和人參中人參皂苷具有明顯的抗炎作用[13-14]。女貞子中有效成分齊墩果酸具有保肝活性和抗炎作用[15]。既往研究表明，糖耐康在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)有改善紊亂的糖脂代謝作用，且臨床療效確切[16-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究以db/db小鼠為NAFLD 模型，db/db小鼠是因基因突變導(dǎo)致瘦素受體缺失，不能產(chǎn)生飽腹感，食量增大而導(dǎo)致脂肪堆積，繼而出現(xiàn)肥胖和高脂血癥等表現(xiàn)。飼養(yǎng)期間，db/db 小鼠肝臟脂肪含量的逐漸增加導(dǎo)致NAFLD，隨后可伴有輕度肝臟炎癥。db/db 小鼠肝臟質(zhì)量明顯高于正常組，而糖耐康干預(yù)后相較于模型組，肝臟質(zhì)量下降。從整體水平觀察糖耐康對db/db 小鼠糖脂代謝的影響，結(jié)果表明，與模型組相比，糖耐康可降低空腹血糖、TG、TC、FFA的含量，降低AST、ALT水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，糖耐康可下調(diào)肝臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達(dá)水平，可顯著下調(diào)p-p38 MAPK、核NF-κBp65 的蛋白表達(dá)水平，表明糖耐康降低db/db 小鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，可能與抑制p38 MAPK/NF-κBp65信號通路有關(guān)。

綜上所述，糖耐康可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/NFκBp65信號通路，改善db/db小鼠的糖脂代謝紊亂和肝功能，減少脂肪在肝臟中的蓄積，下調(diào)肝臟組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達(dá)水平，并對肝臟有一定保護(hù)作用。