擇時針刺足三里穴對炎性痛癥大鼠不同部位TRPV1的影響＊

白艾靈，劉 祎，韋 婷，趙征宇，蔡定均

（成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 成都 610075）

近年研究顯示，TRPV1已然成為研究疼痛離子通道熱點，而TRPV1（香草酸瞬時受體亞型1）能夠在機(jī)體中感受熱、酸以及內(nèi)源性炎癥因子等多種刺激，是炎性疼痛和機(jī)械性刺激的重要因子。眾所周知，TRPV1是外周感覺神經(jīng)元的傷害感受器，在急性和慢性炎癥疼痛中皆具有重要地位，其可識別來自周圍神經(jīng)末梢的感覺輸入，包括疼痛信號，隨著TRPV1通道的激活從而誘導(dǎo)陽離子流入，并進(jìn)一步激活信號傳導(dǎo)途徑[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)含有初級感覺神經(jīng)元，負(fù)責(zé)接收對有害刺激反應(yīng)的疼痛信號，并將信號傳遞給脊髓背角，在疼痛信號的整合、傳導(dǎo)和外周敏化中發(fā)揮重要作用，如有研究表明，表達(dá)TRPV1的背根神經(jīng)元，在通過疼痛、炎癥等刺激而引發(fā)的信號轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。

TRPV1 是感覺痛覺受體的重要信號整合因子，能夠誘導(dǎo)敏化疼痛，若針刺干預(yù)則可通過一系列的應(yīng)答反應(yīng)來達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的[5-6]。大量研究證實，針灸具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，且針刺鎮(zhèn)痛呈現(xiàn)出明顯的節(jié)律性[7-8]。背根神經(jīng)節(jié)（代稱DRG）和脊髓皆作為感覺傳入神經(jīng)元，其與針刺鎮(zhèn)痛具有密切相關(guān)性[9]。針刺能緩解炎性疼痛，但由于針刺手法、穴位的選取和時間點不同，針刺對炎性動物的鎮(zhèn)痛效果均不同。足三里穴在針刺鎮(zhèn)痛研究中運用較為廣泛，對炎癥疼痛亦具有明顯效應(yīng)[10]。

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，以正常動物及弗氏炎癥痛癥等實驗?zāi)Ｐ蜑檩d體，針灸的時辰差異可決定其抑制疼痛的療效的不同，然而此間差異的機(jī)制如何，且該機(jī)制是否與TRPV1通道相關(guān)尚不清楚，故而該研究于前期實驗的條件下，起于弗氏佐劑模型，并以TRPV1的表達(dá)作為效應(yīng)指標(biāo)，選取針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)的痛閾變化最優(yōu)與最差兩個點[11]，研究選擇不一樣的時間點針刺足三里穴對弗氏炎癥痛癥大鼠中多個層次中TRPV1表達(dá)情況，去探索不同時間點針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異機(jī)制與TRPV1不同部位的蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠（Wt：（160-230）g，四川省動物科研中心提供，SCXK（川）2013-15）。在成都中醫(yī)藥大學(xué)時間節(jié)律室內(nèi)飼養(yǎng)，并使用CLOCKLAB 自動調(diào)控光照時間（早上七點開始光照，晚上七點關(guān)閉光照），通風(fēng)1 h/1次，室溫：（21±2）℃。

1.2 實驗試劑

弗氏完全佐劑（以下簡稱CFA，F(xiàn)5881-10ML，101M8711，Sigma-Aldrich生物技術(shù)有限公司）；生理鹽水；TRPV1，兔多克隆抗體（ab63083，abcam 艾博抗貿(mào)易有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備與實驗分組

將所有實驗大鼠于自動光暗周期馴養(yǎng)7 天后，采用輻射熱甩尾法，先進(jìn)行痛閾測定并篩選出實驗對象，痛閾篩選標(biāo)準(zhǔn)為3-10 s 成功甩尾者即納入為實驗大鼠。然后再按照痛閾值隨機(jī)分為待模型復(fù)制組（模型組）和生理鹽水組（空白組）。模型組以1 ml 醫(yī)用注射器在實驗對象右足足底皮下注射0.1 ml CFA，空白組以同樣手段在實驗對象右足足墊部皮內(nèi)注射等量生理鹽水；24 小時后，觀察大鼠右足情況以及其行為從而判斷造模是否成果。將成功獲得的模型實驗鼠，依據(jù)其痛閾數(shù)值隨機(jī)分為兩個實驗組，即模型組、模型針刺組（以下簡稱：模針組），每組按照不同時間點分別處理，又分為ZT8（15:00）、ZT16（23:00）兩個時間組。

2.2 處理方式

模針組：于注射CFA 第二日分別在兩個時間點，即ZT8 和ZT16，給予針刺，選穴足三里穴，共針刺25-35 min，每五分鐘持續(xù)捻轉(zhuǎn)手法行針1 分鐘（頻率：110-130 次/分鐘），即每次針刺共行針5 次，而針刺處理時，需提前使用自制綁鼠工具捆綁老鼠，1日1次，連續(xù)治療7日。

模型組、空白組的實驗大鼠僅進(jìn)行與模針組實驗大鼠以相同自制固定器具并同樣方式捆綁固定30 分鐘處理。

2.3 檢測指標(biāo)

將從大鼠穴區(qū)皮膚、脊髓和DRG 中采集的組織樣本運用免疫組化的方式測定目標(biāo)物的表達(dá)情況，而免疫組織化學(xué)測定結(jié)果顯示標(biāo)志：陽性表達(dá)物、陰性表達(dá)和底色分別標(biāo)記于不同的顏色即為淺黃色或棕黃色、藍(lán)色、白色。使用Media Cybernetics 公司的Image-ProPlus 6.0圖像分析檢測采集的圖像并確定其平均光密度。

2.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計分析軟件對所得實驗數(shù)據(jù)以單因素方差統(tǒng)計方法分析，結(jié)果皆以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±S)表示，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 ZT8時間點針刺調(diào)節(jié)大鼠不同層次中TRPV1的變化情況

ZT8時間點：①在穴區(qū)皮膚中，模型組大鼠皮膚樣本中TRPV1的含量明顯高于空白組大鼠中TRPV1的含量(P＜0.05),而模針組可能由于針刺調(diào)節(jié)的影響其皮膚樣本中TRPV1的表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.05)。②大鼠脊髓中,模型組中脊髓節(jié)段樣本中TRPV1的含量明顯多于空白組(P＜0.05)；模針組脊髓樣本組織中相較于模型組脊髓節(jié)段樣本中TRPV1的表達(dá)明顯下調(diào)了

表1 ZT8時針刺調(diào)節(jié)大鼠多個層次中TRPV1變化情況（± S；n=9）

表1 ZT8時針刺調(diào)節(jié)大鼠多個層次中TRPV1變化情況（± S；n=9）

注：與模型組相比，△P ＜0.05 △△P ＜0.01

背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 0.1523±0.0060△△0.1792±0.0093 0.1581±0.0060△△組別空白組模型組模針組皮膚中TRPV1 0.1729±0.0112△0.1877±0.0092 0.1729±0.0121△脊髓TRPV1 0.1401±0.0108△△0.1614±0.0106 0.1425±0.0111△△

表2 ZT16時針刺對大鼠各個層面組織中TRPV1調(diào)節(jié)情況（± S；n=9）

表2 ZT16時針刺對大鼠各個層面組織中TRPV1調(diào)節(jié)情況（± S；n=9）

注：與模型組相比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 0.1546±0.0051△△0.1735±0.0053 0.1657±0.0062△組別空白組模型組模針組皮膚中TRPV1 0.1735±0.0094△0.1856±0.0069 0.1760±0.0094△脊髓TRPV1 0.1405±0.0057△△0.1504±0.0074 0.1428±0.0060△

TRPV1的表達(dá)量(P＜0.05)。③在DRG 組織中，模型組DRG 中目標(biāo)因子與空白組DRG 樣本中TRPV1的增加量具有顯著差異（P＜0.01）；模針組DRG 樣本組織則比模型組DRG 中TRPV1表達(dá)量下調(diào)許多（P＜0.05）。（見表1、圖1、圖2）

3.2 ZT16 時間點針刺調(diào)節(jié)大鼠各個部位中TPRV1表達(dá)的情況

ZT16 時間點：①穴區(qū)皮膚中，模型組與空白組比較，模型組大鼠皮膚樣本組織中TRPV1的含量明顯增加(P＜0.05)；模針組中大鼠皮膚TRPV1比模型組下調(diào)得更明顯（P＜0.05）②根據(jù)結(jié)果顯示：在脊髓組織中，模型組大鼠脊髓節(jié)段樣本中TRPV1的含量多于空白組（P＜0.01）；經(jīng)過針刺處理后，即模針組大鼠脊髓節(jié)段中TRPV1的表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。③在DRG 組織TPRV1三個實驗組中的變化情況與脊髓中TRPV1的表達(dá)情況類似，即模針組DRG 樣本中目標(biāo)物TRPV1的含量亦明顯減少（P＜0.05）。（見表2、圖3、圖4）

4 討論

近年文獻(xiàn)研究顯示，針灸治療痛癥已經(jīng)成為至關(guān)重要的手段之一。有研究發(fā)現(xiàn)，人類對于疼痛的感受亦具有一定的時間規(guī)律，但不同的病癥表現(xiàn)出來的疼痛的閾值以及閾值最高值的時間亦具有差異性，如膽絞痛、偏頭痛等疼痛閾值最高時大多發(fā)生于夜晚，然而某些關(guān)節(jié)炎性疼痛等疼痛閾值最高時間，大多亦可能發(fā)生于凌晨抑或是上午時段。有研究表明，于整個白晝與黑夜時段，晚上疼痛發(fā)作的次數(shù)較多，特別是上半夜甚至是整個晝夜的頻發(fā)時段[12-13]。以上研究皆顯示出痛癥其本身即具有一定的節(jié)律，而且各種痛癥所表現(xiàn)出來的節(jié)律還存在一定的差異性。

圖1 ZT8時間點大鼠局部皮膚、脊髓及背根神經(jīng)節(jié)TRPV1的表達(dá)(IHC 100×)

圖2 ZT8時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的表達(dá)（IHC 200/400×）

圖3 ZT16時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的表達(dá)(IHC 100×)

圖4 ZT16時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的變化情況（IHC 200/400×）

相應(yīng)地，在近年來的各種研究皆已經(jīng)驗證了時間子午流注法等中醫(yī)傳統(tǒng)的時間針灸療法對于疼痛的治療的明確效應(yīng)，例如，有研究發(fā)現(xiàn)，采用時刻注穴法治療疾病，結(jié)果顯示其與對照組相比療效具有統(tǒng)計學(xué)意義，且疼痛癥狀亦有明顯改善[14]?，F(xiàn)代基礎(chǔ)研究亦提示了不同時間針刺在針刺鎮(zhèn)痛中的重要地位，例如，在不同的間隔時間對佐劑性關(guān)節(jié)炎的大鼠進(jìn)行針刺，針刺對于疼痛的效應(yīng)具有明顯的不同性，于間隔時間的不同進(jìn)行針刺，結(jié)果顯示在整個晝夜后針刺抑制炎癥大鼠疼痛的療效具有顯著的提升，因此本研究提出針刺的時間跨距的差異所產(chǎn)生的抑制疼痛的效應(yīng)的差異性，有可能與阿片肽基因密切相關(guān)[15]。有相關(guān)研究選用不同時間電針針刺，以此來觀察外傷疼痛模型實驗大鼠血漿褪黑素的濃度，在不同時間點針刺，結(jié)果顯示正常大鼠血漿褪黑素濃度具有顯著節(jié)律性,模針組治療后血漿褪黑素濃度與模型組相比較，該濃度有一定的增加；而其節(jié)律性則和空白組類似，表明針刺可能會影響大鼠松果體分泌的褪黑素，且與外傷疼痛所引起的褪黑素節(jié)律紊亂的恢復(fù)具有密切關(guān)系[16]。因此針刺抑制疼痛的療效確切，且具有一定的節(jié)律性。

疼痛具有保護(hù)作用，但其失調(diào)會對個人的生活產(chǎn)生負(fù)面影響，炎癥性疼痛可由神經(jīng)系統(tǒng)傷害感受器引起，且炎性化疼痛通常會引起神經(jīng)纖維周圍化學(xué)環(huán)境的高敏性。據(jù)研究顯示，引發(fā)的炎性疼痛，通過動作電位、通道、受體和信號分子向上游傳導(dǎo)至脊柱或皮質(zhì)腦區(qū)，從而引起一系列的疼痛反應(yīng)；炎性疼痛抑或由外周組織損傷或炎癥引起，增加質(zhì)子、組胺、三磷酸腺苷等的釋放，這些物質(zhì)的過度表達(dá)進(jìn)一步導(dǎo)致外周和中樞致敏則引發(fā)疼痛[17-19]。疼痛的傷害感受器廣泛分布于機(jī)體的各個組織，TRPV1作為對傷害性刺激有反應(yīng)的重要通道，其在皮膚細(xì)胞中表達(dá)并充當(dāng)疼痛或信號傳感器；在炎癥局部皮膚中釋放的介質(zhì)可能有助于外周致敏，特別是通過TRPV1致敏，從而促進(jìn)疼痛的發(fā)生[20]。在脊髓及背根神經(jīng)節(jié)的痛覺神經(jīng)末梢和背角淺層均分布有TRPV1，其神經(jīng)元感知外界有害刺激并傳遞信息到脊髓背角和三叉神經(jīng)脊束核，從而在炎癥痛癥和神經(jīng)源性痛癥中起著至為關(guān)鍵作用[21]?？傊装Y疼痛通過各種信號通路來調(diào)節(jié)TRPV1的活性，以使得TRPV1的激活從而促進(jìn)痛覺過敏的產(chǎn)生和維持。

有研究顯示，針刺作為一種物理刺激，針刺刺激后可通過相應(yīng)的神經(jīng)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起不同的反應(yīng)。脊髓為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，作為感覺傳導(dǎo)的神經(jīng)元，其在針刺鎮(zhèn)痛的過程中起著不可或缺的作用[9,13]。背根神經(jīng)節(jié)含有初級感覺神經(jīng)元，負(fù)責(zé)接受對有害刺激反應(yīng)的疼痛信號，從外周神經(jīng)元傳遞的信號刺激脊髓傷害感受神經(jīng)元，最后導(dǎo)致中樞敏化，其在這一過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色[22]。研究者發(fā)現(xiàn)，在炎性疼痛過程中，TPRV1可以被P 物質(zhì)等激活，再被PKC 磷酸化，然而電針針刺足三里穴可以通過影響某些物質(zhì)的變化，從而達(dá)到抑制疼痛的目的23-24]。電針雙側(cè)足三里后，DRG 和脊髓中TRPV1水平皆顯著減少，這表明針刺可以通過下調(diào)其TRPV1的過度表達(dá)或增加過多，來達(dá)到舒緩炎性痛癥的目的。背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1水平亦與炎性疼痛的表達(dá)密切相關(guān)，以皮下注射完全弗氏佐劑來建立炎性疼痛模型，結(jié)果觀察到在注射弗氏佐劑后第6天DRG中TPRV1的含量顯著增加，然而電針后可以觀察到其表達(dá)顯著下調(diào)[25-26]。足三里穴區(qū)皮膚由脊髓神經(jīng)節(jié)段所發(fā)出的神經(jīng)支配，刺激足三里穴可以通過一定通路影響到脊髓背角的反應(yīng)機(jī)制[27]。因此，針刺鎮(zhèn)痛的機(jī)制不僅僅涉及單獨的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，而表明鎮(zhèn)痛效應(yīng)是由多層次、多水平的綜合整合來反應(yīng)的。

相應(yīng)地，TRPV1是機(jī)械性刺激和熱刺激的感受器，是研究疼痛機(jī)制中的特異性靶點，同時其與疼痛傳導(dǎo)過程關(guān)系密切；有研究顯示脊髓背角TRPV1表達(dá)的增加對初級中樞的功能具有致敏性[4,18,28]。有研究發(fā)現(xiàn)TRPV1和時鐘基因Cry2 之間具有密切的關(guān)系，不僅如此，TRPV1的晝夜節(jié)律表達(dá)模式與晝夜節(jié)律系統(tǒng)之間具有緊密的相互作用[29-30]。該實驗顯示在ZT8 與ZT16時，炎性痛癥大鼠中穴區(qū)皮膚、脊髓和DRG 中TRPV1的表達(dá)量皆明顯增加或顯著上調(diào)，表明炎性痛癥可能誘發(fā)皮膚、脊髓和DRG 中TRPV1的上調(diào)；且其兩個時間點大鼠穴區(qū)皮膚、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的蛋白含量具有明顯差異，而針刺足三里穴在ZT8、ZT16均顯示此各個組織中目標(biāo)因子TRPV1的表達(dá)明顯下降，此亦進(jìn)一步證明了針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)機(jī)制的復(fù)雜性、多樣性，其不僅僅局限于某一區(qū)域，而是從外周到中樞的多層次、多水平的綜合整合從而達(dá)到針刺鎮(zhèn)痛的作用。

不僅如此，在ZT8、ZT16 針刺治療炎性痛癥大鼠時，大鼠痛閾均顯示升高，但是其痛閾升高程度卻具有明顯差異性，而且其痛閾變化值在ZT8、ZT16 分別呈現(xiàn)出最優(yōu)、最差兩個方面，這也提示針刺時間不同，針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有一定的差異性亦可能與不同時間點各區(qū)域TRPV1 的蛋白含量差異相關(guān)。由上敘述可知，TRPV1與時間鐘基因具有密切聯(lián)系，其可能成為調(diào)控時鐘基因的新參與者，因此，不同時間點出現(xiàn)的針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)的差異性可能與TRPV1本身晝夜節(jié)律的表達(dá)模式相關(guān)，但是其具體如何調(diào)控則并不清楚；而該實驗從多個層面進(jìn)行分析研究了不同時間點針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異與不同部位TRPV1表達(dá)的相關(guān)性，同時為臨床針灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)提供了非常有力的理論依據(jù)，因針對TRPV1可能的上下游信號分子機(jī)制亦未有清晰的研究分析，亦為后續(xù)研究或我團(tuán)隊亦正在針對該問題進(jìn)行下一步的研究奠定了夯實的科學(xué)基礎(chǔ)。