基于“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討蒙藥四味石榴散治療高脂血癥的作用機(jī)制＊

葛莎莎，李建良，蔡淑珍，圖 雅

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心 北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院 通遼 028000；4. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥研究發(fā)展中心 北京 100700）

蒙藥四味石榴散（阿那日-4 味散）源于《觀者之喜》，由石榴（Punica granarum L.）、肉桂（Cinnamomum cassia Presl）、白 豆 蔻（Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.）、蓽茇（Piper longum Linn.）等四味藥組成；具有補(bǔ)充胃火，開胃，助消化，除巴達(dá)干赫依，揭除隱熱之掩蔽功能[1]。臨床用于不消化病、灰白巴達(dá)干、胃呆、胃火衰敗等癥。方中石榴乃是祛寒藥物之首，為主藥；肉桂味辛性熱、膩、銳、滑，具抑制巴達(dá)干赫依，祛除巴達(dá)干寒邪的作用，為輔藥；蓽茇性熱以調(diào)理體素，補(bǔ)充胃火，除巴達(dá)干赫依，為佐藥；豆蔻止吐，開胃，消食，補(bǔ)充胃火，為使藥。

高脂血癥（Hyperlipidemia）亦稱為高脂蛋白血癥（hyperlipoproteinemia），屬于代謝綜合癥之一[2]，臨床中血清總膽固醇（total cholesterol，TC）＞6.22 mmol/L或（和）甘油三酯（triglyceride，TG）＞2.26 mmol/L 即被判定為血脂異常升高[3]；我國成人血脂調(diào)查顯示血脂異常發(fā)病率為34.0%，男性發(fā)病率41.9%高于女性發(fā)病率32.5%[4]，且逐年增加；易引發(fā)動脈粥樣硬化，冠心病，腦卒中等高死亡率疾病，危害大。其發(fā)病多與飲食方式、肥胖、年齡、及家族遺傳等因素相關(guān)[5-6]。發(fā)病機(jī)制與載脂蛋白（Apo）基因突變，低密度脂蛋白受體（LDLR）異常，脂肪代謝酶活性降低等相關(guān)[7]。

蒙藥四味石榴散是經(jīng)典蒙藥復(fù)方，是蒙醫(yī)治療消化不良、巴達(dá)干赫依等病的基礎(chǔ)方劑，比如在阿那日-4 湯復(fù)方的基礎(chǔ)上加紅花制成通拉嘎-5，主要用于消化不良、巴達(dá)干赫依等病。臨床研究[8-9]表明五味清濁散能夠明顯降低高脂血癥患者血清的TC、TG、LDL-C水平。方中石榴[10]、蓽茇[11]、肉桂[12]等單藥均有降血脂功效報道，但該類復(fù)方的降血脂現(xiàn)代研究報道較少見。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、整合藥理學(xué)等多學(xué)科配合的優(yōu)勢[13]，適合分析中藥及民族藥多成分多靶點多通路、整體性特點[14]，能很好提供方劑多靶點交互信息網(wǎng)，方便富集方劑藥理通路及闡釋作用機(jī)制[15]。因此，本研究嘗試用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)將四味石榴散作用靶點與降高血脂靶點進(jìn)行對接，旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索四味石榴散降高血脂作用機(jī)制，為開發(fā)四味石榴散臨床新應(yīng)用及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究提供思路。

1 材料與方法

表1 四味石榴散活性化合物

1.1 藥物活性化合物獲取及篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[16]、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）對四味石榴散中四味藥所含全部化合物進(jìn)行搜集。根據(jù)口服利用度（OB）＞0.30 與類藥性（DL）＞0.10 制定篩選標(biāo)準(zhǔn)，將1.1 所搜集的化合物根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，以四味藥中具有藥理活性報道的化合物為優(yōu)先篩選；將其輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫查詢并轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式。

1.2 活性化合物靶點預(yù)測

將1.1 活性成分的SMILES 格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺[17]，物種屬性為“Homo sapiens”，收集預(yù)測到的所有靶點，并除重。

1.3 高脂血癥疾病潛在靶點的搜集

采用Pubmed 中疾病分類中高脂血癥相關(guān)的“hyperlipidmedia”“dyslipidemia”為關(guān)鍵詞，通過OMIM（http://www.omim.org/），DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home） ， DiGSeE （http://210.107.182.61/geneSearch/）以及GeneCard（http://www.genecards.org/）四個疾病靶點網(wǎng)站搜集高脂血癥的潛在靶點，并除重，與1.3 獲得的成分靶點相匹配，相一致者為四味石榴散治療高脂血癥的潛在靶點。

1.4 生物過程與通路的富集分析

將靶點導(dǎo)入至string（https://string-db.org/）[18]分析網(wǎng)站，進(jìn)行靶點蛋白交互作用分析；將潛在靶點導(dǎo)入至Metascape[19]平臺，對四味石榴散進(jìn)行GO 和KEGG通路分析，分析其結(jié)果，并采用Cytoscape3.5.1[20]和GraphPad Prism 7.0軟件對結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 四味石榴散活性化合物

四味石榴散中石榴主要含有鞣質(zhì)、生物堿、黃酮類等成分，蓽茇主要含有生物堿、萜類、揮發(fā)油等成分；肉桂、白豆蔻主要以揮發(fā)油成分為主。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫，通過口服生物利用度和類藥性制定標(biāo)準(zhǔn)篩選，最終獲得16個具有較高活性的化合物（見表1）。

2.2 靶點預(yù)測及篩選

基于Swiss Target Prediction 平臺來預(yù)測活性化合物的潛在靶點，篩選probability ＞0并除重，共獲得391個靶點。通過與DisGeNET、GeneCard、OMIM、DiGSeE疾病數(shù)據(jù)庫中高脂血癥的相關(guān)靶點進(jìn)行比對，最終篩選出35 個可能與四味石榴散治療高脂血癥相關(guān)的靶點（表2）。

2.3 基因功能和通路富集分析

2.3.1 靶點互相作用分析

利用String 分析得出12 個聚類結(jié)果，最高enrichment score 為3.06，包 含 脂 質(zhì) 代 謝（lipid metabolism）、類固醇代謝（steroid metabolism）、膽固醇代 謝（cholesterol metabolism）、固 醇 代 謝（sterol metabolism）四個條目（見圖1）。聚類結(jié)果顯示，HMGCR、PPARA、PPARG、HIFA1、IL-6 等靶點與其他靶點蛋白連接較多。

表2 35個可能與四味石榴散治療高脂血癥相關(guān)的靶點

圖1 靶點相互作用結(jié)果圖

2.3.2 GO通路分析

將四味石榴散治療高脂血癥的35 靶點上傳到Metascape 平臺，經(jīng)GO 注釋分析分子功能(Molecular Function，MF）和生物過程(biological process，BP），設(shè)置閾值P＜0.01，minimum count 3、enrichment factor ＞1.5，共收集到374 條MF 條目，360 條BP 條。通過Kappa scores 作為相似性參數(shù)，將相似性＞0.3 的條目進(jìn)行分層聚類分析并通過Cytoscape3.5.1 軟件繪制富集分析聚類網(wǎng)絡(luò)圖（圖1A、圖1B），每個條目由節(jié)點表示，圓形大小與輸入基因的數(shù)量成正比，而相同顏色的節(jié)點屬于同一簇，每一簇當(dāng)中選擇P 值作為代表展示在右下角。具有相似性得分＞0.3 的條目由邊連接，邊的粗細(xì)表示相似性得分的高低。

圖2 GO注釋分析圖

圖3 KEGG富集分析熱圖

四味石榴散35個預(yù)測靶點的BP 富集結(jié)果顯示大部分與脂質(zhì)定位，合成，轉(zhuǎn)運（lipid localization, lipid biosynthetic process，lipid transport）、膽 固 醇 代 謝（steroid metabolic process）、羧酸代謝（monocarboxylic acid metabolic process）等生物過程相關(guān)，另與激素水平的調(diào)節(jié)（regulation of hormone levels,hormone metabolic process）聯(lián)系密切；MF 富集結(jié)果顯示與多肽反應(yīng)（response to peptide），脂質(zhì)儲存功能（lipid storage），受體合成（receptor biosynthetic process）等分子功能有關(guān)。

2.3.2 KEGG通路富集分析

基于Metascape 網(wǎng)站的KEGG 富集分析平臺，將35個活性靶點導(dǎo)入，富集分析共獲得31條KEGG 信號通路，通過聚類分析，選擇有代表性的條目采用GraphPad Prism 7.0 對其結(jié)果進(jìn)行熱圖可視化（圖3）。有脂肪消化與吸收（Fat digestion and absorption）、Thelper type 17 （Th17） 細(xì) 胞 分 化（Th17 cell differentiation），花生四烯酸代謝（Arachidonic acid metabolism），PPAR 通路（PPAR signaling pathway），膽汁分泌（Bile secretion），血管平滑肌收縮（Vascular smooth muscle contraction），腺苷單磷酸信號通路（cAMP signaling pathway），神經(jīng)活動受體-配體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）。

2.3.3 四味石榴散治療高脂血癥“活性成分-靶點-通路”

將上述所得到的的化合物、作用靶點和富集的GO 與KEGG 通路信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。在輸出的網(wǎng)絡(luò)（圖4）中，以不同顏色的節(jié)點表示化合物、靶點以及作用通路，其中：黃色菱形節(jié)點代表全石榴活性成分，紅色六邊形節(jié)點代表作用靶點，淺藍(lán)色長方形代表作用通路。若某一靶點為活性化合物的潛在靶點，則以邊相連，若某一蛋白對某條通路具有調(diào)節(jié)作用，也通過邊連接。從圖中可以看出四味石榴散具有多種活性成分，每種成分對應(yīng)多個作用靶點及通路，體現(xiàn)出“一對多”和“多對一”藥理作用關(guān)系。

3 討論

圖4 四味石榴散化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

蒙醫(yī)理論認(rèn)為，高脂血癥是由于飲食不節(jié)，過食甘涼、油膩食物，引起體內(nèi)消化巴達(dá)干增盛，三根紊亂，胃火衰敗，繼而肝臟的色變希拉無法“分清泌濁”導(dǎo)致血中精華不消，糟粕粘液增多引發(fā)高脂血癥[21]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，高脂血癥屬于代謝不良疾病，甘油三酯和膽固醇產(chǎn)生過多或代謝減慢導(dǎo)致血漿中LDL 升高[3]，甚至堆積在血管壁引發(fā)心血管疾病[22]；蒙醫(yī)常選用以調(diào)理胃火，祛巴達(dá)干寒，消食，開胃的石榴為主藥的復(fù)方制劑，譬如四味石榴散、五味清濁散（四味石榴散加紅花）等。為發(fā)掘復(fù)方蒙藥降高血脂的研發(fā)開辟新途徑，在防治高血脂癥領(lǐng)域里增添蒙醫(yī)藥的新內(nèi)容，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索了四味石榴散主要活性成分，對接了與高血脂相關(guān)的靶點及作用通路，闡述了蒙醫(yī)治療高脂血癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的聯(lián)系。

String 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示HMGCR 與其他靶點聯(lián)系密切，HMGCR 為膽固醇合成過程的限速酶，提示蒙藥四味石榴散可能是通過下調(diào)HMGCR活性，限制膽固醇合成，下調(diào)LDL 降低高血脂。GO 富集分析結(jié)果顯示集中在脂肪酸的合成、轉(zhuǎn)運和代謝，以及胰島素和激素水平調(diào)節(jié)有關(guān)，說明四味石榴散通過多靶點起效，從糖脂代謝到激素調(diào)節(jié)都有參與降脂的生物過程；KEGG 富集分析顯示主要參與通路有脂肪酸代謝通路，PPAR 信號通路，文獻(xiàn)報道PPAR 可調(diào)控肝臟內(nèi)的脂肪酸氧化代謝，降低甘油三酯，維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[23]，提示四味石榴散作用靶器官可能為肝臟，通過提高肝內(nèi)脂肪酸的氧化分解降低LDL的生成。

成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)充分展示了四味石榴散多成分、多靶點、多通路治療高脂血癥的作用特點。方劑中含有的槲皮素可降低血清和肝組織TC，TG 含量，激活PPARγ/LXRα通路[24]提高清道夫受體表達(dá)從而降低膽固醇蓄積[25]；鞣花酸具有抑制內(nèi)源性TC、TG 合成，升高HDL-C，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運，改善脂質(zhì)在體內(nèi)的沉積，具有抗氧化保護(hù)肝細(xì)胞功能[26]；胡椒堿及其衍生物可調(diào)節(jié)脂代謝紊亂[27]，能有效降低高血脂地鼠血清TC、TG 水平[28]；蓽茇寧可上調(diào)高血脂地鼠LDLR 數(shù)量，降低ApoB數(shù)量，增加LDL代謝來降低血脂水平[29]。蒙藥四味石榴散方劑中的槲皮素，鞣花酸，胡椒堿，蓽茇寧預(yù)測出靶點較多，富集的通路LogP 值高，提示在方劑中這些化合物活性高，起主要降血脂作用，與文獻(xiàn)報道相一致。另免疫系統(tǒng)在本研究結(jié)果中表現(xiàn)突出，參與血脂調(diào)節(jié)密切，花生四烯酸途徑說明機(jī)體高血脂狀態(tài)容易引發(fā)炎癥；Th17 細(xì)胞為CD4+T 細(xì)胞分化亞型之一，與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）為一對平衡，文獻(xiàn)報道高脂血癥會使肝T 細(xì)胞向Th17 分化，Treg 細(xì)胞功能降低，機(jī)體處于免疫亢進(jìn)狀態(tài)，易引發(fā)由高血脂轉(zhuǎn)變的動脈粥樣硬化等心血管疾病[30-31]，因此Th17 細(xì)胞分化通路參與提示適應(yīng)性免疫在高脂血癥發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

生物信息學(xué)的快速發(fā)展使得小分子化合物庫得以全面建立，目前，已構(gòu)建出TCMSP 等多種適合研究篩選中醫(yī)藥活性小分子的化合物庫，結(jié)合分子對接技術(shù)可展現(xiàn)出中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，初步闡明既包括中醫(yī)藥多靶點多通路整體論治的特色，也具有現(xiàn)代化醫(yī)藥精準(zhǔn)醫(yī)療的理念；符合中醫(yī)藥現(xiàn)代化和推廣國際的方針；同時，民族醫(yī)藥也緊隨其后，本研究中的蒙藥四味石榴散在臨床應(yīng)用已久，主要機(jī)理為“分清泌濁”，但具體作用機(jī)制尚未明確，通過對蒙藥四味石榴散進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其可通過cAMP 信號通路、PPAR 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等起到調(diào)節(jié)血脂，降膽固醇作用，為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。目前，基于計算機(jī)模擬的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有一定局限性，算法的匹配程度直接影響對接結(jié)果，其準(zhǔn)確度還需實驗驗證，但仍不失為一種有力手段。

綜上所述，蒙藥四味石榴散可通過干預(yù)與脂肪酸代謝、激素調(diào)節(jié)、免疫穩(wěn)態(tài)等相關(guān)通路，起到祛巴達(dá)干赫依的作用來治療高脂血癥，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供了思路。