大柴胡湯對2型糖尿病模型大鼠氧化應激致胰島β細胞損傷的影響＊

崔艷榮，周 琦，朱向東＊＊

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 蘭州 730000；2. 嘉峪關市峪泉鎮(zhèn)衛(wèi)生院院 嘉峪關 735100）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetesmellitus，T2DM）占糖尿病發(fā)病的90%[1]，持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身各個組織器官的損害及其功能障礙和衰竭，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。氧化應激是引起2型糖尿病的發(fā)生及發(fā)展的重要因素[2]。研究表明氧化應激會引起胰島β細胞功能損傷及外周組織胰島素抵抗最終導致糖尿病的形成，嚴重者更會導致糖尿病神經(jīng)病[3]、糖尿病視網(wǎng)膜病[4]和糖尿病心血管病[5]等多種并發(fā)癥的形成。研究初步證實[6-8]，大柴胡湯通過改善糖代謝、改善胰島素抵抗、增加外周組織對胰島素的敏感性從而發(fā)揮治療2型糖尿病的作用。本實驗通過構建糖尿病大鼠模型探討大柴胡湯治療2 型糖尿病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸研所實驗動物中心購買50 只SPF 級雄性SD 大鼠，7 - 8 周齡，體重（200 ±20）g，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學綜合樓實驗室，環(huán)境溫度（23.0±2.0）℃，相對濕度（35±5）%，換氣量10-20次/h，日光燈采光，明暗交替，空白組常規(guī)充足飼料喂養(yǎng)，其他組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜。實驗動物合格證號：SYXK甘2015-0005。

1.1.2 主要藥物及試劑

大柴胡湯制備：按原方柴胡八兩，大黃二兩，枳實四枚，半夏半升，黃芩三兩，芍藥三兩，大棗十二枚，生姜五兩，其中一兩按15.6 g計算[9]稱取飲片，8倍藥量水浸泡30 min，加熱煮沸，文火煎煮1 h，趁熱過濾；按同法再煮1 次，合并2 次濾液，文火濃縮至含生藥量1 g·mL-1。鹽酸二甲雙胍緩釋片（0.5 g/片，正大天晴藥業(yè)集團，20170616）；辛伐他汀片（20 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，20170524）。

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、TC、TG、FFA比較（± s,n = 8）

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、TC、TG、FFA比較（± s,n = 8）

注：FBG，空腹血糖；HbA1c，糖化血紅蛋白；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯；FFA，游離脂肪酸；與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與二甲雙胍組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01；

FFA/(mmol·L-1)0.439±0.027 0.662±0.020**0.521±0.011△△0.575±0.128△△▲▲☆☆0.599±0.122△△組別正常對照組模型組辛伐他汀組大柴胡湯組二甲雙胍組FBG/(mmol·L-1)4.900±0.622 24.850±1.348**19.400±1.268△△15.350±0.827△△▲▲14.250±1.245△△HbA1c/%2.200±0.141 11.875±0.478**10.525±0.350△△8.800±0.868△△▲▲8.350±0.420△△TC/(mmol·L-1)1.757±0.142 8.230±0.642**3.363±0.489△△7.002±0.356△△▲▲6.517±0.725△△TG/(mmol·L-1)0.810±0.127 5.273±0.267**2.583±0.189△△3.278±0.557△△▲3.690±0.557△△

鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigmag 公司，20180326）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）試劑盒（上海酶聯(lián)公司）；Real-time PCR 試劑盒（美國Promega公司，0000229426）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備與實驗分組

50 只雄性SD 大鼠適應性喂養(yǎng)3 天后隨機選取10只作為空白對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。其余40只高糖高脂飼料（組成：67%大小鼠維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+ 2.5%膽固醇+ 0.5%膽酸鈉）誘導四周后腹腔注射鏈脲菌素（STZ）25 mg·kg-1造模，一周后再次注射STZ（25 mg·kg-1）。腹腔注射三天后用血糖儀測隨機血糖，以不同兩日隨機血糖≥16.7 mmol/L 的大鼠為成模大鼠[10]，造模成功后繼續(xù)給予大鼠高脂高糖飼料，并將成模大鼠隨機分為模型組、大柴胡湯組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，每組10只。模型對照組、空白對照組給予生理鹽水10 mL/kg/d 灌胃，大柴胡湯組給予大柴胡湯10.1 g/kg/d 灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他汀20 mg/kg/d灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍300 mg/kg/d灌胃，共8周。

1.2.2 標本收集

末次給藥后，大鼠禁食12 h（不禁水），尾靜脈血檢測空腹血糖（FPG）。然后給予10%水合氯醛溶液（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉成功后腹主動脈取血，將血液標本分為兩部分保存，一部分置于抗凝管（含肝素）中4℃保存，用于糖化血紅蛋白（Hb A1c）檢測，另一部分靜置后分離血清置于EP管中-20℃存放，用于檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧族（ROS）的濃度?？焖俜蛛x胰腺組織，一部分使用4%多聚甲醛固定并置于4℃冰箱中存放，用于胰腺組織HE 染色；另一部分置于凍存管內(nèi)在-80℃冰箱保存，主要用于RT-qPCR 檢測胰腺組織中PDX-1、MaFAmRNA的表達。

1.2.3 觀察指標

1）一般情況觀察；2）空腹血糖，生化檢測HbA1C、TG、CH、FFA；3）測定ROS、MDA、SOD 的含量，計算抗氧化比值SOD/MDA；4）檢測胰腺PDX-1、MafA mRNA表達；5）鏡下觀察胰腺病理形態(tài)的改變。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，若試驗數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，組間樣本比較采用單因素方差（ANVOA）分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。檢驗水準α= 0.05；若試驗數(shù)據(jù)呈偏正態(tài)分布，數(shù)據(jù)分析結果使用四分位數(shù)和中位數(shù)的間距表示。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)比較

空白對照組大鼠一般精神狀況良好，動作、反應靈敏，毛色白有光澤，進食、飲水量及尿量均正常，體重逐漸増加；模型對照組逐漸出現(xiàn)精神狀態(tài)差、反應遲鈍，皮毛污穢發(fā)黃且無光澤，明顯多飲、多食、多尿，體重増長緩慢。大柴胡湯組和辛伐他汀組、二甲雙胍組大鼠狀態(tài)介于兩組之間。治療后，大柴胡湯組和辛伐他汀、二甲雙胍組大鼠狀態(tài)均較模型對照組改善，體重增長較空白對照組緩慢，但較模型組明顯。

2.2 各組大鼠FBG、TG、TC、HbA1c、FFA比較

表1 示，與正常組對照相比，模型組FBG、HbA1c、TC、TG、FFA 顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，辛伐他汀組、大柴胡湯組、二甲雙胍組FBG、HbA1c、TC、TG、FFA 顯著降低（P＜0.01）；與辛伐他汀組相比，大柴胡湯組TG 降低（P＜0.05），F(xiàn)BG、HbA1c、TC、FFA 顯著降低（P＜0.01）；與二甲雙胍組相比，大柴胡湯組FFA 顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)BG、HbA1c、TC、TG 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠ROS、SOD、MDA比較

表2 示，與正常組對照相比，模型組ROS、SOD、MDA 顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，辛伐他汀組、大柴胡湯組、二甲雙胍組ROS、SOD、MDA 顯著降低（P＜0.01）；與辛伐他汀組、二甲雙胍組相比，大柴胡湯組ROS、SOD、MDA差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 胰腺PDX-1、MafA mRNA表達比較

表3示，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠胰腺組織PDX-1、MaFA mRNA 表達顯著下降（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，辛伐他汀組、大柴胡湯組、二甲雙胍組大鼠胰腺組織PDX-1mRNA 表達顯著升高（P＜0.01），二甲雙胍組大鼠胰腺組織MaFA mRNA 表達升高（P＜0.05），辛伐他汀組、大柴胡湯組大鼠胰腺組織MaFA mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）；與辛伐他汀組相比，大柴胡湯組PDX-1、MaFA mRNA 表達顯著下降（P＜0.01）；與二甲雙胍組相比，大柴胡湯組PDX-1、MaFA mRNA差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 鏡下觀察胰腺病理形態(tài)的改變

正常對照組大鼠胰腺中有大量正常的胰島分布，組織結構清晰，細胞排列整齊，腺泡小葉完整；模型組與正常組相比較僅見少量殘存的胰島，結構紊亂，腺泡小葉輪廓破壞部分出血壞死，炎性細胞浸潤明顯；辛伐他汀組與模型組相比較，有散在新生胰島分布，染色均勻，腺泡小葉結構較為完整，可見少量炎性細胞浸潤；大柴胡湯組和二甲雙胍組與模型組相比較，隨著給藥劑量的增加有散在新生胰島分布明顯，胰島較模型組明顯增加，偶見少量的炎性細胞浸潤。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學對T2DM 的認識，認為T2DM 屬于中醫(yī)“消渴”的范疇。“消渴”的病機主要是陰津虧損，燥熱偏盛，陰虛為本，燥熱為標，臨床表現(xiàn)以多飲多食多尿，身體消瘦為主，俗稱“三多一少”。但“三多一少”往往是T2DM 發(fā)展到晚期才會出現(xiàn)的表現(xiàn)。隨著人民健康意識的提高及醫(yī)療檢測技術的進步，T2DM 的早期診出率越來越高，患者被診斷為T2DM 時往往處于早中期，此時患者并不會有明顯的“三多一少”的表現(xiàn)。臨床治療時若遵循以往中醫(yī)學對T2DM 的認識，療效就會大大降低。仝小林教授通過觀察T2DM 的發(fā)病過程以及當今人們飲食習慣的改變，并結合內(nèi)經(jīng)中關于消渴的論述，提出T2DM 早中期類似內(nèi)經(jīng)所記載的脾癉，其核心病機是中滿內(nèi)熱?！捌D”是發(fā)展至“消渴”的重要階段。中醫(yī)認為脾主運化，脾將胃中的水谷化為精微物質(zhì)并布散于全身各個臟器，糖是精微物質(zhì)的一種，若脾失運化將會使糖類物質(zhì)蓄積于血液中，無法布散到各個器官，引起血糖升高，然后進展為糖尿病。

表2 各組大鼠血清ROS、SOD、MDA比較（± s,n = 8）

表2 各組大鼠血清ROS、SOD、MDA比較（± s,n = 8）

注：ROS，活性氧；SOD，超氧化物歧化酶；MDA,丙二醛；與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與二甲雙胍組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01。

MDA/(ng·mL-1)0.45±0.42 1.44±0.17**0.43±0.04△△0.40±0.04△△0.47±0.15△△組別正常對照組模型組辛伐他汀組大柴胡湯組二甲雙胍組ROS/(ng·mL-1)48.32±3.64 79.05±3.99**51.75±10.29△△42.95±15.77△△46.90±18.21△△SOD/(ng·mL-1)1.17±0.31 1.62±0.22**1.17±0.22△△1.06±0.67△△1.04±0.13△△

表3 各組大鼠胰腺組織中PDX-1、MaFA mRNA表達量比較（± s,n = 8）

表3 各組大鼠胰腺組織中PDX-1、MaFA mRNA表達量比較（± s,n = 8）

注：PDX-1，胰腺-十二指腸同源盒-1；MaFA，肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源A 基因；與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與二甲雙胍組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01；

MaFA 1.000 0.113±0.033**0.800±0.105△△0.536±0.080△△▲▲☆☆0.293±0.062△組別正常對照組模型組辛伐他汀組大柴胡湯組二甲雙胍組PDX-1 1.000 0.100±0.025**0.858±0.089△△0.572±0.103△△▲▲☆☆0.264±0.086△△

2 型糖尿病早期的病理基礎是胰島素抵抗，多伴有肥胖、血糖、血脂等異常[11]。仝小林教授認為2 型糖尿病早期類似于《內(nèi)經(jīng)》所記載的“脾癉”[12]，并提出2型糖尿病早期的核心病機是中滿內(nèi)熱或脾虛胃熱，主要證型有肝胃郁熱證、腸道濕熱證、胃腸實熱證。針對肝胃郁熱型2 型糖尿病臨床多選用“開郁清熱”之法，大柴胡湯是其代表方。

大柴胡湯屬于經(jīng)典名方，出自張仲景所著《傷寒論》第103條，其臨床應用非常廣泛，可治療多種疾病。大柴胡湯主治少陽陽明合病，癥狀多見往來寒熱、胸脅苦滿、嘔不止、郁郁微煩、心下痞硬，其主要病機是肝胃郁熱、日久痰濁血瘀[13]。大柴胡湯由柴胡、大黃、枳實、半夏、黃芩、芍藥、大棗八味藥組成，方中重用柴胡為君藥，配以黃芩疏利肝膽，清熱解郁，條達肝氣，清解郁熱；大黃、枳實瀉熱毒，破積滯，瀉陽明熱結，行氣消痞；芍藥柔肝緩急，配大黃通腑泄熱；半夏和胃降逆；大棗配伍生姜調(diào)和脾胃。從大柴胡湯的藥物組成可以看出大柴胡湯具有開肝郁、清胃熱之功。

T2DM 多因過食肥甘厚味，精神過度緊張而致病。長期過食肥甘導致脾運呆滯，食物不得及時腐熟、運化，胃氣阻滯則腑氣不暢，水道壅塞；脾氣不運則濕濁內(nèi)停，日久化熱，入血則濁?！鹅`樞·五變篇》云：“五臟皆柔弱者，善病消癉”，“夫柔弱者，必有剛強，剛強多怒，柔者易傷也……怒則氣上逆，胸中蓄積，血氣逆留，皮充肌，血脈不行，轉而為熱，熱則消肌膚，故為消癉”揭示了肝與消癉的關系。T2DM 初始多六郁相兼為病，中焦氣機之升降，與肝的疏泄密切相關，長期過食肥甘脾運呆滯，土壅木郁，脾土反侮肝木，再加之精神因素的影響，肝疏泄功能失常，氣郁血滯，郁而化熱，發(fā)為消癉。顧此類T2DM 的治療應重在舒肝解郁、清肝瀉肝，同時宜加用活血化瘀的藥物。大柴胡湯全方苦寒而不傷胃，辛溫而不生燥、祛瘀而不傷正，絲絲入扣，相得益彰，標本同治，恰切T2DM 早期“中滿內(nèi)熱，肝郁氣滯”的病機[14]。

氧化應激是指機體受到刺激后體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失去平衡，也就是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）生成太多而抗氧化系統(tǒng)無法將其完全清除[15]，產(chǎn)生了大量的氧化中間產(chǎn)物進而導致機體的損傷。生理條件下，自由基不斷生成，又不斷被清除，維持著動態(tài)平衡。機體受到缺氧、缺血、高血糖、高血脂等因素刺激后，ROS 產(chǎn)生過多，抗氧化系統(tǒng)清除氧化物的能力下降，機體常規(guī)的動態(tài)平衡被打破。未能及時清除的ROS和RNS 導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子損傷，進而引發(fā)機體組織和細胞損傷，導致多種疾病的發(fā)生。

機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)主要有兩類，以超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）為主的抗氧化酶系統(tǒng)和以維生素C 為主的非酶抗氧化系統(tǒng)，機體通過這兩大系統(tǒng)使自由基體系的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡狀態(tài)。SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）是機體內(nèi)最主要的清除自由基的抗氧化酶，對維持機體氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡起到了非常重要的作用。SOD 是一種天然的抗氧化酶，可以清除細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)，對細胞維持氧化與抗氧化起重要作用，通過檢測細胞內(nèi)SOD 變化可以反映細胞遭受氧化應激的水平[16]。機體在病理狀態(tài)下可導致機體內(nèi)ROS大量生成，當機體內(nèi)的抗氧化酶SOD、GSH-Px 等活性降低，自由基清除速率減慢時，會導致機體內(nèi)自由基水平升高引起機體氧化應激狀態(tài)。機體內(nèi)的自由基多數(shù)是不穩(wěn)定的，具有很強的反應活性，可以啟動高效鏈鎖反應生成脂質(zhì)過氧化物、新的自由基、分解產(chǎn)物和衍生物，所以直接檢測自由基是非常困難的，多以檢測其產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化物含量來間接測定機體氧化應激水平。反映機體氧化應激水平常用的指標是脂質(zhì)過氧化程度，目前用于檢測的主要產(chǎn)物為丙二醛（malondialdehyde，MDA），MDA 是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物之一，能間接反映機體氧化應激狀態(tài)[17]。

氧化應激主要從兩方面促進糖尿病的發(fā)生發(fā)展:①誘導β細胞功能受損，②誘發(fā)外周組織胰島素抵抗。而外周組織胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷和/或數(shù)量不足是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[18]。70% ～80%的2 型糖尿病患者伴有胰島素抵抗（IR），IR[19]是指胰島素的反應性下降，正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生物學效應，表現(xiàn)為胰島素抑制肝釋放葡萄糖的能力和促進周圍組織利用葡萄糖的能力不足。機體為了將血糖恢復到正常水平，將會代償性分泌更多胰島素來降低血糖值，從而產(chǎn)生一系列病理變化。胰島素抵抗在T2DM 的發(fā)病及病程進展中有著至關重要的作用，胰島素在體內(nèi)的作用受到氧化應激的影響，氧化應激可加重外周組織胰島素抵抗。外周胰島素抵抗導致機體對血糖血脂的利用減少，體內(nèi)利用不了的糖類和游離脂肪酸發(fā)生自身氧化產(chǎn)生大量自由基，誘導氧化應激[20]。

氧化應激反應亦能影響胰島β細胞的合成和胰島素的分泌。胰腺啟動因子1（Pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）是胰腺特異性表達轉錄因子，也是一個核心因子，可進行多基因調(diào)控，其主要作用是促進P 細胞的分化和胰島素的分泌，調(diào)控胰島素的基因轉錄、修飾和排出維持胰島β細胞的正常功能[21]。氧化應激會影響PDX-1的表達，可減少PDX-1 mRNA的合成[22]。實驗證明對2 型糖尿病模型db/db 小鼠進行抗氧化治療后，胰島細胞核內(nèi)的PDX-1 mRNA 的表達明顯增多了[23]。氧化應激還能導致PDX-1 與胰島素基因啟動子的結合減少，影響PDX-1 的核質(zhì)易位，而PDX-1 核質(zhì)易位是促進胰島素分泌的重要過程。所以氧化應激狀態(tài)下，PDX-1 表達減少，胰島素的合成和分泌也會減少。

MafA 是一種胰島β細胞中特異性表達的蛋白，是調(diào)節(jié)胰島素基因表達和調(diào)控胰島β細胞成熟的重要轉錄因子，對胰島素基因轉錄、胰島素分泌和胰島β細胞團的增殖、分化起著至關重要的作用[24]。有研究表明，MafA 與其他轉錄因子PDX-1、NeuroD 或Ngn3 協(xié)同作用可促進非胰島β細胞轉化為分泌胰島素的細胞。而且PDX-1 的表達也受到胰島β細胞中的MafA 基因的調(diào)控；T2DM 患者胰腺β細胞中MafA的含量顯著減少，間接證明了MafA 的減少與人類T2DM 患者的β細胞功能受損相關[25]。

氧化應激反應參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，與糖尿病的關系也非常密切[26]。

本次實驗結果中與正常組對照相比，模型組ROS、SOD、MDA 顯著升高，這表明糖尿病模型組大鼠抗氧化能力下降，體內(nèi)自由基生成增加，清除率降低，細胞內(nèi)ROS 生成增多，氧化應激反應增強。藥物治療8 周后，與模型組相比，大柴胡湯組ROS、SOD、MDA 顯著降低；結果提示大柴胡湯可增強糖尿病大鼠抗氧化酶活性，增強清除氧自由基的能力。

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠胰腺組織PDX-1、MaFA mRNA 表達顯著下降，表明模型組大鼠β細胞及其功能受損，藥物干預8 周后，與模型組大鼠相比，大柴胡湯組大鼠胰腺組織PDX-1mRNA、MaFA mRNA表達升高，同樣提示大柴胡湯能保護胰島細胞，抑制胰島細胞損壞進程。

本研究成功建立了2 型糖尿病實驗動物模型，證實了高糖高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔小劑量注射STZ 誘導2型糖尿病實驗動物模型的可靠性。進一步證實了大柴胡湯可以調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠糖脂代謝，改善IR，提高外周組織對胰島素的敏感性，保護胰島β細胞。大柴胡湯在調(diào)節(jié)糖脂代謝的基礎上，又能增強抗氧化物酶的活性，減少脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物，減少糖尿病大鼠氧自由基的產(chǎn)生，增強糖尿病大鼠抗氧化能力。本實驗探討了大柴胡湯治療2 型糖尿病的部分機制，但也不能排除其他多種途徑的綜合作用對胰腺細胞的影響，并且大柴胡湯的成分復雜，有關大柴胡湯對胰島細胞的保護機理仍需進行后續(xù)實驗進行驗證，其抗糖尿病的作用機制還有待于我們的進一步全面而深入的研究，以期能為大柴胡湯防治T2DM 提供更多的實驗依據(jù)。