丹皮酚對大鼠心肌梗死后心臟功能的改善及其對Pink1/Parkin的影響＊

劉 超，王明娟，范彥芳，單偉超＊＊

（1. 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 承德 067000；2. 承德醫(yī)學院 承德 067000）

0 前言

隨著人們生活水平的不斷提高，生活節(jié)奏的加快，我國心血管疾病患者越來越多，中國已經(jīng)成為心血管疾病負擔最重的國家之一[1]。其中，冠狀動脈粥樣硬化型心臟病的發(fā)病率、死亡率日趨上升，嚴重威脅人類的健康和生活質(zhì)量，不僅患病人數(shù)在中國飛速增長，冠心病也已成為全球第一位的死亡原因[1]。急性心肌梗塞（acute myocardial infarction，AMI）往往是冠心病的首發(fā)表現(xiàn)[2]，在過去的十幾年中，心梗的預后已經(jīng)得到了極大的改善，但其治療方法還很有限，療效也還不夠理想[3-4]。常用的治療手段（如再灌注治療）雖然減少了心肌梗死面積[5]，但也使得更多人進入心梗后心室重構(gòu)階段，增加了心臟衰竭發(fā)生的風險[6]。因此，探究如何改善或逆轉(zhuǎn)患者的心室重塑情況，對進一步提高心?；颊叩念A后具有積極意義。

在心梗發(fā)生時，心肌細胞氧和營養(yǎng)供應的短缺常導致線粒體功能障礙，此時，有效的線粒體自噬緩沖了線粒體功能紊亂帶來的心臟毒性作用[7]，因此，通過使用靶向作用于線粒體的藥物，可以達到顯著減少住院率，改善心室功能的作用[8]。丹皮酚（paeonol）是分離自中藥牡丹、芍藥的干燥根皮的具有廣泛生物活性的物質(zhì)。丹皮酚曾被發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)控miR-1-PI3K-AKT軸提高心臟功能，減輕炎癥，并增強心肌細胞自噬[9]，這提示丹皮酚對心梗后心室重構(gòu)和心臟功能可能具有一定的改善作用，但其具體機制尚未完全闡明。

中醫(yī)是中國醫(yī)療體系的重要組成部分，在西方醫(yī)療市場不斷擴大的同時，中醫(yī)市場也在不斷擴大，尤其在心腦血管疾病方面對于中醫(yī)的需求極大[10]。在心梗治療方面，中醫(yī)也具有廣泛的應用，但由于其缺少臨床數(shù)據(jù)支撐，配方復雜，機制難以闡明，阻礙了中醫(yī)的進一步發(fā)展和國際化[10-11]。因此，有必要對中醫(yī)配方中活性成分的功能及其機制開展探究。本研究通過建立心肌梗死的細胞模型和動物模型，首次觀察丹皮酚對結(jié)扎冠狀動脈前降支（LAD）誘導的MI 大鼠的治療作用，并從線粒體自噬及Pink1/Parkin 角度探討其可能的作用機制，為將丹皮酚開發(fā)成防治心血管疾病的新藥提供有價值的藥理實驗依據(jù)，并為進一步改善心梗治療手段和闡明中藥作用機制提供理論基礎。本研究是河北省衛(wèi)生計生委醫(yī)學科學研究重點課題項目（20181153）的一部分，并由其提供經(jīng)費支持。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人心肌細胞H9C2 購買于American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，Virginia），將細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清并添加了1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中（Gibco，Grand Island，NY，USA），于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

采 用Lipofectamin 2000 將siRNA-Pink1 轉(zhuǎn) 染H9C2 細胞。細胞用0.25%胰酶消化后接種于6 孔板中，調(diào)整細胞密度為1 × 105個/孔。待細胞生長至80%-90%融合時，胰酶消化、收集細胞，隨機分為空載體對照組（轉(zhuǎn)染空載體）、轉(zhuǎn)染組。繼續(xù)培養(yǎng)96 h。

1.2 心肌細胞缺氧模型的建立

當H9C2 細胞生長至80%匯合度以上，棄去原培養(yǎng)液，更換為缺氧培養(yǎng)液（125 mM NaCl，8 mM KCl，1.2 mM KH2PO4，1.25 mM MgSO4，1.2 mM CaCl2，6.25 mM NaHCO3，5 mM s 乳酸鈉，and 20 mM HEPES，pH 6.6），置于缺氧培養(yǎng)箱（GasPakTM EZ，BD Biosciences，Shanghai，China）中，根據(jù)制造商的說明書，調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境為10%CO2和1%O2，培養(yǎng)2 小時。所有細胞分為三組：①對照組：正常培養(yǎng)；②缺氧組：置于缺氧環(huán)境和缺氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)；③丹皮酚組：置于缺氧環(huán)境和添加了100 μM的丹皮酚的缺氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3 動物模型

將SD 大鼠用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，氣管插管，小型動物呼吸機輔助呼吸，鈍性分離第4 或第5 肋間肌進入第4 或第5 肋間肌進入胸腔，用眼瞼撐開器支撐開肋間，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部約3 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支（假手術(shù)組只開胸剪破心包，在相應部位掛線不結(jié)扎），以心電圖出現(xiàn)ST 段抬高1/2 以上、左室前壁顏色變蒼白視為MI 模型成功，逐層縫合關(guān)胸，待自主呼吸恢復后，拔掉氣管插管，術(shù)后24 h 將存活大鼠分為MI組、MI+丹皮酚（12 mg/kg）組和Pink1 敲低組（同時進行丹皮酚灌胃處理和尾靜脈注射2.5 mg/kg si-Pink1），手術(shù)第二天開始灌胃給藥，給藥周期4 周。設置假手術(shù)組，開胸，掛線不結(jié)扎。本實驗已經(jīng)獲得本院動物倫理委員會批準。

1.4 大鼠血流動力學和超聲心動檢測

經(jīng)胸超聲心動圖采用高分辨率超聲心動系統(tǒng)（Visual Sonics，Toronto，Canada），檢測左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、室間隔厚度（IVSD）、左室后壁厚度（LVPWT）、左室縮短分數(shù)（FS）、左室射血分數(shù)（EF）。使用生物機能采集系統(tǒng)BL-420S（Techman，Chengdu，China）檢測左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮末壓（LVDP）、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dt）。

1.5 ELISA

收集大鼠血漿和試驗后的細胞培養(yǎng)液，根據(jù)制造商的說明書，使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（Multisciences（lianke） biotech，co.，ltd，Hangzhou，China）檢測乳酸脫氫酶（LDH）活性和肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性。

1.6 Western blot

收集細胞，用預冷RIPA 裂解液（Beyotime Biotcchnology，Shanghai，China）冰 上 孵 育20 min，13000 r/min，4℃，離心20 min。離心后取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性5 min。采用12% SDS-PAGE 電泳1.5～2 h，轉(zhuǎn)至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。采用3% BSA的TBST 溶液在室溫封閉膜。加入稀釋好的一抗（anti-Pink1 兔抗人多克隆抗體，1:1000，ab23707 或anti-Parkin 小鼠抗人單克隆抗體，1:1000，ab77924 或anti-Mfn2 兔抗人多克隆抗體，1:1000，ab50838或anti-Beclin1 兔抗人多克隆抗體，1:1000，ab62557 或anti-LC3A/B 兔抗人多克隆抗體，1:1000，ab128025 或antip62 抗體，小鼠抗人單克隆抗體，1:1000，ab56416），放4℃過夜。TBST 洗膜5 次，每次3min。加入稀釋好的二抗（山羊抗兔IgG 1:2000，ab205718 或山羊抗小鼠IgG 1:2000，ab205719），室溫輕搖40min，TBST 洗膜6次，每次3 min。ECL（Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK）顯影、定影和掃描。用軟件ImageJ分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值作為蛋白相對表達量進行分析。所有抗體均購自Abcam（Shanghai，China）。

1.7 TUNEL

孔板中各組細胞干預如前所述，去培養(yǎng)基，PBS洗滌一次。用免疫染色固定液固定細胞30～60 min，PBS洗滌一次。加入免疫染色洗滌液，冰浴孵育2 min。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液（Beyotime Biotechnology，Shanghai，China），37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，每份樣品隨機選取5個視野，計算細胞凋亡率：凋亡率=凋亡細胞／總細胞×100%。

1.8 統(tǒng)計分析方法

本研究的數(shù)據(jù)全部使用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行處理分析，計量資料采用“平均數(shù)±標準差”（x±s）表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚減輕了心肌細胞損傷

本研究通過缺氧處理人H9C2 細胞建立了心肌細胞梗死的細胞模型，并通過100 nM的丹皮酚對其進行了處理以觀察丹皮酚的作用。通過ELISA，本研究發(fā)現(xiàn)心肌損傷標志物LDH、CK-MB 因丹皮酚的處理而顯著減少（圖1A，圖1B）。另外，TUNEL 的結(jié)果提示，H9C2細胞凋亡也因丹皮酚的處理而減輕（圖1C）。這些結(jié)果共同提示丹皮酚對心肌細胞具有保護作用。

2.2 丹皮酚通過Pink1/Parkin促進了心肌自噬

為了探究丹皮酚是否影響了心肌細胞自噬，本研究通過western blot 對相關(guān)蛋白進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹皮酚的處理顯著促進了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（圖2B），Pink1、Parkin、Beclin-1 和Mfn2 的表達均顯著增高（圖2C-F），而p62 表達水平則降低，這說明丹皮酚對心肌細胞自噬具有促進作用。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬相關(guān)通路蛋白Pink1 和Parkin 的表達水平均顯著增高（圖2G），這提示丹皮酚可能通過影響Pink1/Parkin通路促進心肌細胞自噬。

2.3 敲低Pink1 減弱了丹皮酚促進心肌細胞自噬的作用

為了進一步探究丹皮酚的作用機制，本研究通過向H9C2 細胞中轉(zhuǎn)染了si-Pink1 以敲低Pink1 的表達，再次觀察丹皮酚對H9C2 細胞的影響。本研究先通過Western blot 對Pink1/Parkin 的表達水平進行了檢測，確認其確實被敲低了（圖3B，C）。此外，本研究觀察到敲低Pink1 后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平的比值顯著降低，Beclin-1 和Mfn2 的表達水平顯著下降，而p62 蛋白表達量顯著增加（圖3D-G）。這說明丹皮酚導致的自噬被Pink1的敲低抑制了。

2.4 敲低Pink1減弱了丹皮酚對心肌細胞的保護作用

為了進一步檢測Pink1 對丹皮酚作用的影響，本研究對敲低Pink1 后丹皮酚發(fā)揮的對心肌細胞的保護作用進行了檢測。本研究觀察到與Paeonol 組相比。Paeonol+si-Pink1 組中心肌損傷標志物LDH 和CK 的含量顯著增高（圖4A，B），細胞凋亡率同樣也增高了（圖4C）。本研究的結(jié)果說明敲低Pink1逆轉(zhuǎn)了丹皮酚的作用，提示丹皮酚通過激活Pink1/Parkin 信號通路促進線粒體自噬發(fā)揮其保護心肌細胞的功能。

2.5 丹皮酚對大鼠心臟組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達的影響

本研究通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支在SD 大鼠體內(nèi)建立了心肌梗死的動物模型，并通過向大鼠體內(nèi)注射si-Pink1 敲低了Pink1 的表達。本研究通過western blot對大鼠心臟組織中Pink1和Parkin的表達進行了檢測，確認了si-Pink1 注射的效果（圖5B，C）。本研究進一步觀察到，丹皮酚提高了SD大鼠心臟組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平的比值，提高了Beclin-1和Mfn2的表達水平并顯著降低了p62的表達，這些結(jié)果在Pink1敲低后均被逆轉(zhuǎn)（圖5D-G）。以上結(jié)果提示丹皮酚通過激活Pink1/Parkin通路促進了SD大鼠心梗后的細胞自噬。

2.6 丹皮酚對大鼠心臟功能的影響。

本研究進一步觀察了丹皮酚對大鼠心臟功能和心室重構(gòu)情況的影響。通過超聲心動圖，本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，心梗組SD 大鼠LVESD、LVEDD、IVSD 顯著增高，LVPWT、FS 和EF 顯著下降，丹皮酚逆轉(zhuǎn)了這種影響（圖6A-F）。此外，本研究還觀察到心梗組大鼠LVEDP 顯著增高，LVDP 和± dp/dt 顯著降低，丹皮酚同樣在這些指標中逆轉(zhuǎn)了心梗的影響（圖大鼠心臟功能，減輕了心室重塑情況。至此，本研究通過體內(nèi)外的實驗，發(fā)現(xiàn)并證實了丹皮酚至少在一定程度上通過激活Pink1/Parkin 通路，促進心肌細胞線粒體自噬，進而在心肌梗死的進程中發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

圖1 丹皮酚對缺氧環(huán)境中H9C2細胞的保護作用

圖2 丹皮酚對自噬相關(guān)蛋白的影響

圖3 敲低Pink1對自噬相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 敲低Pink1對丹皮酚保護心肌細胞的影響

圖5 丹皮酚處理和敲低Pink1后對大鼠心臟組織中自噬相關(guān)蛋白的表達

3 討論

心肌梗死是導致心衰的重要原因[6]。目前，關(guān)于丹皮酚減輕心肌梗死情況的報道尚且不多，其潛在機制也尚未闡明。本研究通過建立心肌梗死的細胞模型和大鼠模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可以通過影響Pink1/Parkin信號通路，增強心梗過程中的線粒體自噬，從而減輕心肌損傷，改善心梗后心室重構(gòu)情況，提高心臟功能。

在心肌梗死過程中，線粒體功能紊亂是導致心肌細胞損傷的主要機制之一，心肌發(fā)生缺血時，心肌細胞內(nèi)的鈣超載將導致線粒體內(nèi)鈣含量增加，這導致了線粒體腫脹及其膜的通透性改變，并增加了心肌細胞內(nèi)的代謝壓力，而線粒體通透性過渡孔的開啟和線粒體外模的通透性增加將啟動心肌細胞壞死和凋亡的進程[12]。因此，通過自噬更新線粒體對于維持線粒體功能和心臟功能十分重要。本研究的研究發(fā)現(xiàn)，無論在缺氧培養(yǎng)的H9C2 心肌細胞中或在心肌梗死大鼠的心臟組織中，丹皮酚均顯著提高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，Beclin-1、Mfn2 表達同時增高，p62 表達則顯著減少，提示丹皮酚促進了心梗進程中的細胞自噬。進一步的研究則表明，丹皮酚減弱了心肌細胞的損傷和凋亡，改善了大鼠心臟功能，逆轉(zhuǎn)了心梗導致的心室重構(gòu)。而當抑制線粒體自噬中的重要蛋白Pink1 后，丹皮酚的效果同樣被抑制了。本研究的結(jié)果說明丹皮酚通過促進線粒體自噬減輕了心梗過程中的心肌損傷和心室重構(gòu)。曾有研究報道，丹皮酚和丹參素的聯(lián)合作用激活了Nrf2 通路，減少了心肌細胞的氧化應激反應，抑制了細胞凋亡[13]；另一項關(guān)于無復流的研究表明，丹皮酚顯著減少了心肌梗死面積，改善了心臟功能[14]。這些研究發(fā)現(xiàn)的丹皮酚保護心肌細胞、恢復心臟功能的作用和我們發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致。另外，也有不少研究發(fā)現(xiàn)，促進心梗過程中線粒體自噬改善了心梗病情。如利拉魯肽通過促進SIRT1 的表達，激活了Parkin通路，進而促進了線粒體自噬，抑制了心梗過程中的心肌纖維化、炎癥反應和心肌細胞死亡[15]。PEDF通過促進心梗過程中FUNDC1 調(diào)控的心肌細胞中線粒體自噬顯著減輕了心肌細胞損傷[16]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的作用機制相類似。因此，本研究通過體內(nèi)外的實驗，發(fā)現(xiàn)丹皮酚具有保護心肌的作用，證明了丹皮酚具有潛在的應用于改善心梗后心室重塑的能力。

圖6 丹皮酚對大鼠心臟功能及心室重構(gòu)的影響

Pink1/Parkin 是調(diào)控線粒體自噬的重要通路。發(fā)生線粒體功能障礙時，Pink1 降解異常，聚集于線粒體膜上，激活Parkin 的E3 連接酶活性，啟動自噬過程[17]。Mfn2 是識別Pink1/Parkin 通路中識別受損線粒體的重要蛋白，Mfn2募集Parkin于受損線粒體，Parkin則通過一種依賴于Pink1 的方式與Mfn2 結(jié)合[18-19]。本研究通過使用丹皮酚處理缺氧培養(yǎng)的H9C2 細胞，發(fā)現(xiàn)丹皮酚顯著提高了Pink1 和Parkin 的表達。敲低Pink1 后丹皮酚的效果被部分抑制。這些結(jié)果共同證實，丹皮酚至少在一定程度上通過Pink1/Parkin 通路發(fā)揮其保護心肌的作用。類似的，有研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿可以通過激活Pink1/Parkin 通路減輕H9C2 受到的缺氧/復氧損傷[20]，這與本研究的結(jié)果相類似。此外，丹皮酚還曾被報道可以促進了Nrf2 的核轉(zhuǎn)位[21]，不僅Nrf2 的缺失可以加速心梗后心衰的進程，Nrf2 還可以和Pink1 發(fā)生相互作用[22]，并調(diào)控了線粒體自噬[23]。丹皮酚也有可能通過這些對心肌細胞自噬產(chǎn)生一定的影響，更深層次的作用機制尚未被發(fā)現(xiàn)。在心肌梗死的進程中，Pink1 還發(fā)揮了減少線粒體碎片化的作用，鑒于丹皮酚促進Pink1表達的功效[24]，丹皮酚可能也會有類似的效果，這將進一步恢復線粒體功能，對減輕心肌細胞損傷有積極意義，但這還需要進一步探究。

總而言之，本研究通過體內(nèi)外的實驗，闡釋了丹皮酚通過上調(diào)Pink1/Parkin，促進H9C2 心肌細胞中的線粒體自噬，進而減輕了心肌細胞損傷，改善了心臟功能，逆轉(zhuǎn)了心室重構(gòu)。本研究的研究提示丹皮酚具有一定的應用于臨床防治心梗后心室重構(gòu)的能力，并為丹皮酚的臨床應用進一步提供了理論基礎。