核盤菌中ITC水解酶可增強病原菌的致病力（2020.6.21 Plant Biotechnology Journal ）

幾乎所有生物都使用化學(xué)防御來抵御其天敵，這樣的防御可能會對病原菌微生物的繁殖產(chǎn)生負(fù)面影響。植物會使用一種策略在需要時激活無毒原毒素的生產(chǎn)來阻止病原體和草食動物攻擊同時避免自身中毒。例如，十字花科植物產(chǎn)生氨基酸衍生的硫代葡萄糖苷（GLs），其在組織受損時被β-硫代葡萄糖苷葡糖水解酶（黑芥子酶）激活產(chǎn)生有毒的異硫氰酸鹽（ITC）和腈。這種策略可以防御許多昆蟲、食草動物和某些病原體的攻擊。但是像菜籽、卷心菜和西蘭花等蕓苔屬作物仍遭受特定昆蟲和微生物病原體的嚴(yán)重侵襲。一些專門的食草昆蟲和動物可以代謝GL防止毒性ITC形成。但是，大多數(shù)草食動物不會阻止GL的活化，而是使用一般的谷胱甘肽（GSH）途徑來偶聯(lián)GL水解產(chǎn)物，從而使其失活。有趣的是，研究證明細菌還可以對ITC水解產(chǎn)物進行解毒，這與草食動物中的細菌明顯不同，方法是使用稱為ITC水解酶的金屬-β-內(nèi)酰胺酶（MBL）酶將ITC直接降解為羰基硫及其相應(yīng)的胺。最近，在甲蟲中也檢測到ITC代謝的次要產(chǎn)物胺和其相應(yīng)的乙酰化衍生物，但尚不清楚這種轉(zhuǎn)化是由昆蟲本身還是與其相關(guān)的微生物群落產(chǎn)生的。盡管我們了解昆蟲和細菌中的GL代謝，但對GL的真菌代謝以及在十字花科植物中定植的病原真菌如何應(yīng)對GL及其毒性水解產(chǎn)物知之甚少。

近日德國化學(xué)生態(tài)研究所在NC上發(fā)表”The phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum detoxifies plant glucosinolate hydrolysis products via an isothiocyanate hydrolase”的文章。

該文章利用菌核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）具有很強破壞性和地理分布較廣的植物真菌病原體，侵染擬南芥葉片，詳細地探究了GL在植物與核盤菌之間相互作用中的作用

首先作者分別用真菌感染野生型和tgg1/tgg2（葉片黑芥子病的缺陷）和myb28/myb29（脂肪族GL缺陷）的突變體。脂肪族GL缺乏的擬南芥myb28/myb29突變體比具有WT GL水平的植物更容易受到感染。tgg1/tgg2突變體上的核盤菌值比野生型植物上的值要高，該突變體缺乏激活GLs的葉片黑芥子酶，但與myb28/myb29上的定植相似。因此，作者推斷脂族GL通過其水解產(chǎn)物（ITC）有助于植物抵抗病原真菌。為了確定在真菌感染過程中脂肪族GL和ITC的水平是否發(fā)生變化，在菌核和模擬接種的擬南芥中對4MSOB-GL（擬南芥Col-0葉片中最豐富的GL）及其水解產(chǎn)物4MSOB-ITC進行了定量。結(jié)果表明GL系統(tǒng)已在感染初期被真菌激活，而后期ITC的水平降低可能是由于真菌降解ITC所致。為了探索真菌如何修飾這些化合物，作者將核糖鏈球菌培養(yǎng)物分別與4MSOB-GL和4MSOBITC孵育，并通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析來自培養(yǎng)基的樣品。發(fā)現(xiàn)核盤菌通過兩種ITC轉(zhuǎn)化途徑（巰基丙酸結(jié)合途徑和水解降解途徑）降低4MSOB-ITC的濃度。

為了鑒定造成菌核盤菌中ITC降解的相應(yīng)基因，作者從核盤菌中搜索了已知ITC酶SaxA的菌盤菌蛋白同源物。選擇了五個S.sclerotiorum MBL蛋白（SS1G_12040，SS1G_11053，SS1G_01079，SS1G_14439和SS1G_12145）并通過RT-qPCR檢測確定了候選基因Ss12040命名為SsSaxA，酶活實驗證明SsSaxA可以將ITC作為底物進行水解。為了確定SsSaxA基因的缺失是否影響菌核菌中的ITC代謝，作者還創(chuàng)建了SsSaxA突變的菌株進行實驗。將WT和ΔSsSaxA突變體在4MSOB-ITC的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并通過時間過程比較ITC降解率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT真菌降解4MSOB-ITC的速度明顯比ΔSsSaxA突變體快。這些結(jié)果表明，SsSaxA負(fù)責(zé)核盤菌中的ITC水解。為了進一步研究水解途徑對ITC真菌耐受性的重要性，分別暴露于一系列濃度分別為4MSOB-ITC和2PE-ITC的乙醇（EtOH）和DMSO溶液中后，測定WT和ΔSsSaxA真菌的生長。在對照板上，WT和ΔSsSaxA突變真菌的生長速率沒有顯著差異，表明SaxA在正常條件下對于核盤菌的生長和發(fā)育不是必需的。但是，在4MSOB-ITC和2PE-ITC均存在的情況下，ITCase缺乏會導(dǎo)致生長顯著降低。因此，依賴SsSaxA的ITC排毒可以使核盤菌耐受培養(yǎng)基中的ITC。

綜上所述，在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)植物防御主要由兩部分組成。十字花科的GL-黑芥子酶系統(tǒng)在防御真菌感染中起重要作用。GLs對有毒ITC水解產(chǎn)物的活化有助于降低擬南芥對壞死性病原菌S.sclerotiorum的敏感性。