利用“藍(lán)白斑篩選”高效融合微生物學(xué)和基因工程實(shí)驗(yàn)*

孫 娟 趙逸歐 劉長付

（1 北京市第五十七中學(xué) 北京 100038 2 首都師范大學(xué)附屬回龍觀育新學(xué)校 北京 102208 3 北京市第五中學(xué) 北京 100007）

高中階段，選修生物學(xué)的學(xué)生在實(shí)驗(yàn)上需要更多的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，其中包括培養(yǎng)基的配制、無菌操作、微生物的培養(yǎng)和分離、微生物的計數(shù)、微生物的鑒定［1］等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。在基因工程實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)中，還涉及限制酶切割DNA、DNA 的連接、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和篩選［2］等實(shí)驗(yàn)操作。學(xué)生在學(xué)習(xí)中，很多實(shí)驗(yàn)都是做完拋之腦后，甚至有些實(shí)驗(yàn)仍處于紙上談兵階段。因此，在學(xué)習(xí)中保持知識的連貫性，并學(xué)以致用非常重要。文獻(xiàn)調(diào)查顯示，“藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)” 可有效地貫穿以上知識和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容［3－4］，以一個完整的大實(shí)驗(yàn)形成科技實(shí)踐活動。通過實(shí)踐，可促進(jìn)學(xué)生掌握知識，提高能力，提升科學(xué)素養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌細(xì)胞吸收外源DNA 并發(fā)生可遺傳的改變，稱為轉(zhuǎn)化。通過Ca2+處理的化學(xué)方法誘導(dǎo)大腸桿菌進(jìn)入感受態(tài)，有利于外源DNA 進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)［3］。

β－半乳糖苷酶可使顯色底物X－Gal 分解為藍(lán)色，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；若有外源DNA 片段插入至載體中，則β－半乳糖苷酶基因失活，從而產(chǎn)生白色菌落［3－4］。

2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

2.1 材料：受體菌JM109（需在－80℃保存，或在干冰中短時間保存），pMD19－T 載體試劑盒、ITPG溶液、X－Gal、NaCl、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、冰、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、移液器、離心管、培養(yǎng)皿等。

2.2 儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、攪拌器、冰箱等。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

1）將ITPG 和X－Gal 配制為溶液，除菌后冷凍保存，備用。

2）制備LB 液體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、含氨芐青霉素（標(biāo)記為Amp+）的LB 固體培養(yǎng)基，備用。

3）重組質(zhì)粒的制備：實(shí)驗(yàn)組按照下表配制反應(yīng)體系，使Insert DNA 與pMD19－T 載體（質(zhì)粒）連接；對照組將表1 中的Control Insert 替換為等量蒸餾水，其他條件相同。

表1 pMD19-T 中插入Insert DNA 的反應(yīng)體系

4）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌：將實(shí)驗(yàn)組和對照組的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中。①取出2管受體菌置于冰上融化；②冰上操作，將步驟3的反應(yīng)產(chǎn)物分別與受體菌輕打混勻，冰上放置30 min；③熱激法轉(zhuǎn)化：將離心管放置于42℃水浴，熱激90 s，轉(zhuǎn)化中勿搖動離心管；④將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1～2 min；⑤每管加400 μL LB 液體培養(yǎng)基，在37℃搖床緩慢搖動培養(yǎng)45 min，使細(xì)菌復(fù)蘇。

5）制備含ITPG、X－Gal 的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)制）：取適量ITPG、X－Gal 溶液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基表面，晾干。

6）涂板：取100 μL 步驟4 獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)菌分別涂布于添加IPTG、X－Gal 的培養(yǎng)基表面，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h。

7）觀察：實(shí)驗(yàn)組和對照組經(jīng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌落呈現(xiàn)出不同的顏色，若顯色不明顯，可將平板置于4℃培養(yǎng)2～4 h 后再觀察，分別統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)組、對照組中的藍(lán)斑和白斑數(shù)目。

4 結(jié)果與討論

按照以上步驟完成藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)后，需進(jìn)一步根據(jù)菌落的顏色和數(shù)目計算重組效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1（本文附圖見封四）所示。在實(shí)驗(yàn)組里，外源DNA 與T 載體連接成功的會破壞β－半乳糖苷酶基因的表達(dá)，理論上應(yīng)都應(yīng)呈現(xiàn)白斑，但實(shí)際結(jié)果是仍有少量藍(lán)斑存在，推測其原因可能是T載體發(fā)生自連。但是，重組效率為93%可表明，重組比較成功。對照組只加入了T 載體，理論上不會產(chǎn)生白斑，然而實(shí)際上仍有白斑出現(xiàn)，因此，推測T 載體發(fā)生自連時，其末端的部分脫氧核苷酸脫落，使連接后的閱讀區(qū)發(fā)生改變，從而改變mRNA 的序列，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，最終引起性狀差異。

5 小結(jié)

通過藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基的配制、滅菌、無菌操作、DNA 的連接、菌落的計數(shù)等不再是孤立的實(shí)驗(yàn)步驟，而是服務(wù)于一個大的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹巴ㄟ^外源基因的導(dǎo)入，使大腸桿菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，最終產(chǎn)生白色的菌落”。在“藍(lán)白斑篩選”科技實(shí)踐活動中，知識學(xué)習(xí)更加系統(tǒng)化、能力提升更加全面化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和討論還能提高學(xué)生的思辨能力，從而全方位提升學(xué)生的學(xué)科素養(yǎng)和綜合素養(yǎng)。