小麥-華山新麥草異附加系的細胞遺傳學和分子標記輔助鑒定

張德時，王斯文，王長有,2，王艷珍，陳春環(huán)，吉萬全,2，張 宏,2

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100； 2.農業(yè)部作物基因資源與種質創(chuàng)新陜西科學觀測實驗站，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)作為我國主要糧食作物，發(fā)展小麥生產對保障我國糧食生產和安全有重要作用[1]。但遺傳背景日趨狹窄和骨干親本單一[2]的問題制約小麥育種研究，不利于小麥生產。利用遠緣雜交將小麥近緣種作物的優(yōu)異基因導入小麥，可強化種質資源的原始積累，進而推動創(chuàng)新性品種的培育和生產[1]，不斷提高小麥產量和品質[3]。

華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica，2n=2x=14,NsNs)主要分布于陜西華山地帶，是珍稀農作物野生親緣種[4-5]。華山新麥草具有抗病、耐寒、耐瘠薄等眾多優(yōu)異性狀，是小麥抗逆、抗病基因庫[6-7]，如華山新麥草中的果聚糖合成酶(6-SFT)可使煙草增強對非生物脅迫的耐受性[8]，其含有的高分子量谷蛋白可影響小麥品質[9]，將華山新麥草的優(yōu)良性狀基因引入小麥可改善小麥抗病性和貧瘠土壤的耐受性[7,10-11]。在近年來的研究中，如Du等[12-15]報導的1～7Ns附加系和2Ns(2D)代換系以及王秀娟等[16]研究的代換系在抗條銹病和葉銹病、株高和小穗等農藝性狀上都有優(yōu)異表現(xiàn)，既為育種工作者提供了更多可選擇的中間育種材料和種質資源，也證明了華山新麥草染色體的導入會給小麥帶來許多優(yōu)異的農藝性狀。

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst))引起的嚴重病害[17]，可通過空氣傳播造成小麥20%～50%的產量損失[18]。在小麥抵抗條銹菌侵染的長期過程中，國內許多抗性基因逐漸失去了抗性，如Yr1、Yr2、Yr3、Yr9、Yr10、Yr24和Yr26[19]，這與條銹菌小種的頻繁變異有關[19-20]。因此需不斷尋找新抗病基因和抗病品種，有效防控病害和減少作物損失[21]。利用小麥野生近緣種中的豐富基因資源，不斷創(chuàng)制新抗病材料，無疑是小麥育種中重要的基礎性工作 之一。

本課題組前期利用普通小麥7182和華山新麥草的BC1F9代植株獲得三個穩(wěn)定的小麥-華山新麥草衍生系：H1133、H4122和H1423。本研究利用細胞學鑒定、原位雜交鑒定、分子標記分析、形態(tài)學鑒定等方法，分析這3個衍生系中的華山新麥草遺傳物質，評估它們的育種和抗病價值，以期為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為普通小麥品系7182(2n=6x=42,AABBDD)、華山新麥草(2n=2x=14,NsNs)以及小麥(7182)-華山新麥草衍生系H1133、H4122和H1423，感病對照品種輝縣紅。以上材料由西北農林科技大學農學院染色體工程實驗室培育和提供。2016-2019年將試驗材料按照家系點播種植于西北農林科技大學試驗地(陜西楊凌)，目標單株套袋自交獲得后代種子。條銹菌小種CYR32和CYR33，由西北農林科技大學植物保護學院提供。

1.2 細胞學鑒定

于2018和2019年3-4月份，取田間材料的根尖和幼穗。將根尖在冰水混合物中處理24 h，卡諾固定液Ⅰ(乙醇∶冰醋酸= 3∶1，V/V)處理2 d，1%醋酸洋紅染色，45%醋酸壓片，鏡檢。幼穗用卡諾固定液Ⅱ(乙醇∶氯仿∶冰醋酸= 6∶3∶1，V/V/V)處理3 d，用1%醋酸洋紅染色壓片，鏡檢。

1.3 原位雜交鑒定

染色體制片：將供試材料種子放入墊有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在23 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中進行種子發(fā)根處理，待根長至2～4 cm時剪下，N2O處理2 h，90%醋酸冰上固定10 min，置于70%的乙醇中-20 ℃保存。參照Han等[22]方法制備滴片，混合酶液(1%纖維素酶和2%果膠酶)中 37 ℃處理57～59 min(酶解時間因材料而異)。70%乙醇沖洗3次后破碎并離心，除去乙醇，加20 μL冰醋酸，渦旋，取10 μL滴于載玻片上，鏡檢，合格樣品備用。

探針制備：用CTAB法[23]提取華山新麥草基因組DNA，以切口平移法標記華山新麥草基因組DNA探針。參考Tang等[24]的方法，由上海英駿(Invitrogen)生物技術有限公司合成寡核苷酸探針Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2。

原位雜交：參考Lukaszewski等[25]和Yang等[26]的方法，以華山新麥草基因組DNA為探針對材料進行基因組原位雜交(genomicinsituhybridization,GISH)分析；參考Tang等[24]的方法，以寡核苷酸序列Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)為探針對材料進行熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)分析；以1:1的比例混合FISH探針與GISH探針，按照GISH程序對材料進行FISH-GISH同步雜交分析。用OLYMPUS BX-53熒光顯微鏡進行鏡檢，利用DP800 CCD(OLYMPUS)系統(tǒng)進行圖像采集和合成，用軟件Adobe Photoshop CS6進行圖片處理。

1.4 EST和PLUG標記分析

依據(jù)網(wǎng)站http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml、GrainGenes公布的引物信息和部分發(fā)表文獻[12-15,27]中的引物信息，選取位于小麥7個部分同源群上的72對EST-STS引物和88對PLUG(PCR-based landmark unique gene)引物(由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成)對普通小麥7182、華山新麥草、H1133、H4122和H1423進行PCR擴增分析。PCR擴增體系和程序參考Zhang等[28]的方法。

1.5 形態(tài)學鑒定和抗病性鑒定

在試驗材料成熟期進行形態(tài)學鑒定，統(tǒng)計株高、分蘗、穗長、小穗數(shù)和小穗粒數(shù)等農藝性狀，記錄標準參照李立會等[29]方法。小麥-華山新麥草衍生系與普通小麥親本之間的差異顯著性用T測驗方法進行統(tǒng)計分析。

在試驗材料幼苗期時，于西北農林科技大學試驗田對誘發(fā)行輝縣紅接種條銹菌小種CYR32和CYR33的混合菌種。當感病對照輝縣紅充分發(fā)病后，用0～4級分級標準[30]觀察并記錄7182、華山新麥草、H1133、H4122和H1423的條銹病反應型，0級為免疫，0;級為近免疫，1級為高抗，2級為中抗，3級為中感，4級為高感。

2 結果與分析

2.1 細胞學鑒定結果

觀察試驗材料的花粉母細胞，發(fā)現(xiàn)在減數(shù)第一次分裂中期，H1133(圖1a)、H4122(圖1b)和H1423(圖1c)的染色體構型均為22個二價體；觀察試驗材料的根尖體細胞，發(fā)現(xiàn)H1133(圖1d)、H4122(圖1e)和H1423(圖1f)的染色體數(shù)均為44條。各材料的細胞統(tǒng)計數(shù)均達到30以上，可以初步判定H1133、H4122和H1423具有細胞學穩(wěn)定性，且攜帶44條染色體并能穩(wěn)定配對。

圖1 H1133、H4122和H1423的花粉母細胞(a-c)和根尖體細胞(d-f)鏡檢結果

2.2 原位雜交鑒定結果

以華山新麥草基因組DNA為GISH探針(綠)，以Oligo-pTa535(紅)和Oligo-pSc119.2(綠)為FISH探針對H1133、H4122和H1423根尖體細胞進行同步原位雜交鑒定，將結果與Tang等[29]的中國春核型圖對比。發(fā)現(xiàn)H1133(圖2a)、H4122(圖2b)和H1423(圖2c)均含有普通小麥的42條染色體和2條華山新麥Ns染色體。

以華山新麥草基因組DNA(綠色)為GISH探針,以Oligo-pTa535(紅色)、Oligo-pSc119.2(綠色)為FISH探針對根尖體細胞進行同步原位雜交，箭頭代表Ns染色體。

2.3 EST和PLUG標記分析結果

為明確各衍生系含華山新麥草Ns染色體所屬同源群，利用72對EST-STS引物和88對PLUG引物分別對H1133、H4122和H1423的Ns染色體進行部分同源群歸屬驗證。將篩選的特異性標記進行分類統(tǒng)計(表1)，發(fā)現(xiàn)第三同源群中的CD454742(圖3a)、BF473348(圖3b)、CD454575(圖3c)、TNAC1326(圖3d)、TNAC1248(圖3e)可以特異性擴增H1133中華山新麥草特異條帶；第五同源群中BE499166(圖4a)、TNAC1588(圖4b)、TNAC1503(圖4c)可以特異性擴增H4122中華山新麥草特異條帶；第七同源群中BE637663(圖5a)、BG274576(圖5b)、BE591127(圖5c)、TNAC1957(圖5d)、TNAC1821(圖5e)可以擴增出H1423中華山新麥草特異條帶。這說明H1133、H4122和H1423分別攜帶華山新麥草3Ns、5Ns和7Ns染色體。結合細胞學和原位雜交結果，認為H1133、H4122和H1423為3Ns、5Ns和7Ns異附加系。

表1 第三部分、第五部分和第七部分同源群的EST和PLUG標記Table 1 EST and PLUG markers mapped on homeologous group 3,group 5 and group 7

2.4 形態(tài)學鑒定和抗條銹病鑒定結果

為了評價各附加系在育種和抗病研究中的價值，對H1133、H4122和H1423的農藝性狀如株高、分蘗、穗長、小穗和小花等進行了觀察和統(tǒng)計(表2)。比較發(fā)現(xiàn)H1133、H4122和H1423的平均株高比親本7182低約10 cm。H1133和H4122的平均分蘗比7182多1～2個，而H1423少2個。H4122和H1423的平均穗長約11 cm，較親本7182略有增加，T測驗結果差異顯著 (P<0.05)。植株性狀對照如圖6所示，各附加系的穗型變?yōu)榧忓N型。

表2 H1133、H4122、H1423和7182的農藝性狀Table 2 Agronomic traits of H1133,H4122,H1423 and 7182

M：DL2000；1：7182;2:H1133;3:華山新麥草;4:華山新麥草;5:H1133;6:7182；a：CD454742標記；b：BF473348標記；c：CD454575標記；d：TNAC1326標記；e：TNAC1248標記；箭頭所指為華山新麥草特異帶。

M：DL2000；1：華山新麥草;2:H4122;3:7182；a：BE499166標記；b：TNAC1588標記；c：TNAC1503標記；箭頭所指為華山新麥草特異帶。

M：DL2000；1：7182;2:H1423;3:華山新麥草;4:華山新麥草;5:H1423;6:7182；a：BE637663標記；b：BG274576標記；c：BE591127標記；d：TNAC1957標記；e：TNAC1821標記；箭頭所指為華山新麥草特異帶。

成株期抗條銹病鑒定結果(圖7)表明：H1133、7182和輝縣紅表現(xiàn)為感病，華山新麥草、H4122和 H1423表現(xiàn)為抗病。根據(jù)材料系譜推測H4122和H1423的抗性來源為華山新麥草。

1：7182;2:H1133;3:H4122;4:H1423.

1：華山新麥草(IT0);2:H1133(IT3);3:H4122(IT0;);4:H1423(IT0);5:7182(IT3);6:輝縣紅(IT3)。

2.5 探針的特異性檢驗結果

結合細胞學技術和分子技術，鑒定獲得了3Ns異附加系H1133、5Ns異附加系H4122和7Ns異附加系H1423。為了進一步研究這些導入的Ns染色體的特性，以華山新麥草基因組DNA(綠)、Oligo-pTa535(紅)和Oligo-pSc119.2(綠)為探針，對各材料進行先FISH后GISH的鑒定。對比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH探針在H1133(圖8a)、H4122(圖8b)和H1423(圖8c)中的Ns染色體上無特異信號，這說明Oligo-pTa535(紅)和Oligo-pSc119.2(綠)無法有效區(qū)分3Ns、5Ns和7Ns染色體。

箭頭指示Ns染色體。

3 討 論

導入外源染色體的材料在染色體互作研究中有重要意義[31]，可使植株表型產生多種變化，如華山新麥草Ns染色體的導入使H1133、H4122和H1423株高降低、小穗增多，而矮稈、多花等性狀都能直接影響小麥的產量[32-33]。利用遠緣雜交技術將近緣種作物攜帶的優(yōu)異基因轉入小麥，是拓寬小麥遺傳背景的有效方法。但附加系中整條染色體的導入常引入不利性狀的基因，這意味著H1133、H4122和H1423需進一步改良為易位或滲入系，才能提高其利用價值，如Kang等[34]創(chuàng)制的易位系k-13-835-3具有多籽粒和抗條銹病的優(yōu)良性狀。而前人的研究給我們指引了一個新方向，如Zhang等[35]利用60Co-γ對附加系進行輻射處理，將攜帶種子貯藏蛋白基因的簇毛麥1V染色體片段導入中國春，提高了面包品質；Zhang等[36]利用同樣方法將冰草的6P染色體片段導入小麥，創(chuàng)制的易位系顯著提高了小麥千粒重和穗長。因此，利用輻射處理不同的華山新麥草Ns附加系材料，可獲得大量的擁有優(yōu)異農藝性狀的易位系育種材料?？傊A山新麥草是小麥育種研究中的重要基因資源庫，多樣的附加系材料更豐富了小麥的育種資源，為進一步改良和利用華山新麥草中的優(yōu)異基因奠定了基礎，但后續(xù)研究工作仍需我們長期的探索。

在本研究中，探針Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2的組合無法有效區(qū)分3Ns、5Ns和7Ns染色體，間接證明了Ns組染色體與中國春染色體組有著不同的寡聚核酸偏好性。王丹蕊等[37]利用寡核苷酸探針套鑒別長穗偃麥草和中間偃麥草染色體的研究，為本研究進一步利用多樣化的探針組合或新的寡核苷酸探針對不同Ns染色體的快速鑒別提供了借鑒和參考。此外，基因組測序和分析技術的完善為開發(fā)新的寡聚核酸探針提供了契機，而本研究創(chuàng)制的附加系材料為通過基因組學開發(fā)探針提供了基礎材料。在抗條銹病鑒定中，H4122和H1423對條銹病小種CYR32和CYR33混合菌種田間表現(xiàn)為抗病。H1133的田間表現(xiàn)與Du 等[13]的3Ns附加系抗條銹病的鑒定結果存在差異，可能是小種差異或材料遺傳背景差異導致的；Du 等[14]的7Ns附加系研究中未提及有關條銹病抗性的研究，所以本試驗對H1423的研究是對前人成果的補充；馬東方等[40]在華山新麥草易位系H9015-17的5DL上發(fā)現(xiàn)了一個新的抗性基因YrHua1，H4122中的抗性基因是否是其等位基因或華山新麥草的新抗病位點，則需要進一步分析研究?？傊?，普通小麥-華山新麥草附加系H1133、H4122和H1423為育種者提供了更多的選擇機會。