• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    寒地冬小麥 TaEXPA7同源基因的遺傳轉(zhuǎn)化及其功能分析

    2020-07-31 09:05:54趙梓頤徐永清董佳敏武佳文彭麗娜馮珊珊胡寶忠李鳳蘭
    麥類作物學(xué)報(bào) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:側(cè)根角果耐受性

    趙梓頤,徐永清,董佳敏,武佳文,彭麗娜,馮 旭,馮珊珊,胡寶忠,2,李鳳蘭

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.哈爾濱學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

    膨脹素蛋白(expansin)于1992年在黃瓜(Cucumissativus)的下胚軸中首次被發(fā)現(xiàn),其以非酶活性作用機(jī)制并在酸性環(huán)境條件下可以松弛植物的細(xì)胞壁[1]。在植物中,Expansin超家族被分成四個(gè)亞家族,分別為α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB),家族成員之間相對(duì)保守,氨基酸序列同源性介于20%~25%之間[2]。研究表明,膨脹素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用,包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、根的伸長(zhǎng)、花的發(fā)育、果實(shí)成熟及軟化、種子結(jié)實(shí)量等[3]。

    非生物脅迫引起的細(xì)胞壁修飾是植物適應(yīng)環(huán)境的重要組成表現(xiàn),而細(xì)胞壁形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變是由膨脹素等細(xì)胞壁修飾蛋白所調(diào)節(jié),因此膨脹素也廣泛地參與了植物對(duì)外界非生物脅迫的響應(yīng)[4]。在玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)中,膨脹素基因的表達(dá)受水分脅迫所誘導(dǎo)[5];在脫水的玫瑰(Rosahybrida)花瓣中,膨脹素基因RhEXPA4的表達(dá)顯著上調(diào)[6];大麥(Hordeumvulgare)中的膨脹素基因HvEXPB7通過(guò)促進(jìn)根毛的生長(zhǎng)來(lái)提高植物干旱脅迫的耐受性[7]。

    低溫脅迫使農(nóng)作物減產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,東農(nóng)冬麥2號(hào)(D2)作為高抗寒的冬小麥品種,具有寶貴的抗寒基因資源[8]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,D2中膨脹素基因TaEXPB7-B的表達(dá)在D2中受低溫脅迫下的ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑所調(diào)控,且過(guò)表達(dá)TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D基因顯著促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)和低溫脅迫耐受性[9-10]。Zhang等[11]對(duì)小麥進(jìn)行全基因組分析后鑒定出128個(gè)膨脹素基因,其中TaEXPA7-A/B/D基因作為其中的成員已被證實(shí)參與冬小麥對(duì)外界低溫脅迫的響應(yīng)。董佳敏等[12]在D2中克隆了TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因,并證明了這三個(gè)基因的表達(dá)可能與D2的根系建成及低溫脅迫耐受性相關(guān)。

    為進(jìn)一步揭示TaEXPA7-A/B/D基因的功能,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入模式植株擬南芥中,同時(shí)探討了TaEXPA7-A/B/D基因?qū)χ参锷L(zhǎng)和低溫耐受性的影響,以期為冬小麥膨脹素的研究提供新的理論基礎(chǔ),也同時(shí)為作物分子育種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    試驗(yàn)所用擬南芥品種為哥倫比亞(Colombia)野生型擬南芥,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 載體及菌株

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 pBI121-TaEXPA7-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

    通過(guò)PCR在TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn),所用引物見表1所示。利用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI對(duì)上述PCR產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)并送交測(cè)序。

    1.3.2 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

    分別將pBI121-TaEXPA7-A/B/D三個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定,所用引物見表1。

    1.3.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

    通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥,步驟參考Feng等[9]的方法。陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定參考Peng等[10]的方法,通過(guò)RT-PCR對(duì)T1代植株進(jìn)行鑒定,所用引物見表1。

    表1 TaEXPA7-A/B/D基因添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)所用引物信息

    1.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)學(xué)觀察

    分別將野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上,7 d后觀察植株根部的生長(zhǎng)狀態(tài)并測(cè)定根長(zhǎng),待植株生長(zhǎng)至4葉期后播種于營(yíng)養(yǎng)缽(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)中并放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16/8 h光周期,25/20 ℃晝夜溫度),15 d后觀察葉片生長(zhǎng)情況,30 d后觀察并測(cè)定株高,花序出現(xiàn)后分別統(tǒng)計(jì)花后1~3周單個(gè)植株的花序和角果數(shù)目。對(duì)于側(cè)根的觀察,擬南芥種子播種于1/2 MS垂直板上,10 d后觀察并統(tǒng)計(jì)植株的側(cè)根數(shù)目。

    1.3.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的 影響

    擬南芥的種植方法同1.3.4,取生長(zhǎng)40 d且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株置于4 ℃培養(yǎng)箱中,分別于處理后0、3、6 d剪取擬南芥葉片。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性,以及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量的測(cè)定均按照試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)的方法。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有試驗(yàn)均至少重復(fù)3次(n=9),數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD,GraphPad Prism 5用于差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pBI121- TaEXPA7-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

    在TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn),PCR結(jié)果如圖1所示。對(duì)pBI121及上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,提取菌落進(jìn)行PCR并測(cè)序,陽(yáng)性菌落的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。將測(cè)序結(jié)果正確的pBI121-TaEXPA7-A/B/D質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中,陽(yáng)性菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖3所示。條帶大小與圖1和圖2一致,說(shuō)明TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因成功整合進(jìn)植物表達(dá)載體中。

    M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000;1: TaEXPA7-A; TaEXPA7-B; TaEXPA7-D。

    M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000;1:pBI121-TaEXPA7-A;2:pBI121-TaEXPA7-B;3:pBI121-TaEXPA7-D。圖3同。

    2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

    對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代植株的RT-PCR鑒定結(jié)果如圖4所示,結(jié)果表明TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因已成功轉(zhuǎn)化至擬南芥中并表達(dá)。

    M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000;1:野生型(WT)植株;2和3: TaEXPA7-A轉(zhuǎn)基因植株;4和5: TaEXPA7-B轉(zhuǎn)基因植株;6和7: TaEXPA7-D轉(zhuǎn)基因植株。

    2.3 過(guò)表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥的形態(tài)學(xué)分析

    對(duì)在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的擬南芥植株進(jìn)行根部觀察,并測(cè)定根長(zhǎng),結(jié)果(圖5,表2)顯示,TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了植株根的伸長(zhǎng)和根毛的生長(zhǎng)。對(duì)在垂直板上生長(zhǎng)10 d的擬南芥植株進(jìn)行側(cè)根觀察,并統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)目,結(jié)果(圖6,表2)顯示,過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因植株的平均側(cè)根數(shù)目分別為 40.00、46.00和35.67,均顯著高于野生型。TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因?qū)M南芥葉片生長(zhǎng)及株高的影響。結(jié)果(圖7,表2)表明,轉(zhuǎn)基因植株的葉片數(shù)目顯著多于野生型,且TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因轉(zhuǎn)基因植株的株高相比于野生型分別顯著增加了10.18%、20.25%和8.89%。TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥花序和角果數(shù)目的影響。結(jié)果(表3)顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在花后1~2周的花序數(shù)和角果數(shù)均顯著低于野生型;而花后3周,轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序和角果生長(zhǎng)迅速,過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B兩個(gè)基因擬南芥的花序數(shù)目和過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/D兩個(gè)基因擬南芥的角果數(shù)均顯著高于野生型。

    表3 野生型和過(guò)表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株花序和角果數(shù)目的比較

    表2 野生型和過(guò)表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株主要特征性狀的比較

    A為葉片形態(tài);B為株高表型。

    圖6 TaEXPA7-A/B/D基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀L(zhǎng)的影響

    A:根長(zhǎng)形態(tài);B和C:根毛的生長(zhǎng)狀態(tài)。

    2.4 TaEXPA7-A/B/D基因?qū)M南芥在低溫脅迫下生理指標(biāo)的影響

    對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥植株在4 ℃處理下的生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果(表4)顯示,轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶SOD、POD及CAT的活性相比于野生型在正常生長(zhǎng)條件和4 ℃處理下均維持在較高的水平,且MDA的積累量較低。在低溫處理6 d后,過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中SOD的活性分別為590.18、691.44和610.94 U·g-1,均顯著高于野生型。低溫處理3 d后,野生型植株中POD的活性提高了115.91%,為950 U·g-1,分別為轉(zhuǎn)TaEXPA7-A/B/D基因植株的 25.13%、27.86%和21.49%。過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中MDA的含量在處理后6 d分別為11.61、12.56和11.95 nmol·g-1,均顯著低于野生型。正常生長(zhǎng)條件下野生型及轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸的含量并無(wú)顯著差異,但在低溫處理3 d后過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A植株中脯氨酸的含量顯著增加,為野生型的1.42倍。植株中可溶性糖含量的測(cè)定結(jié)果顯示,正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株中的含量均維持在較低的水平,顯著低于野生型;但隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),野生型植株中的含量逐漸下降,而轉(zhuǎn)基因植株中則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),在處理后6 d轉(zhuǎn)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中可溶性糖的含量均顯著高于野生型,分別為5.63、6.64和5.35 mg·g-1。

    表4 低溫脅迫下野生型和過(guò)表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株中生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

    3 討 論

    膨脹素基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng),這一觀點(diǎn)已經(jīng)被很多研究所證實(shí),如在擬南芥中過(guò)表達(dá)玫瑰的膨脹素基因RhEXPA4能夠增加植株的側(cè)根數(shù)[13];水稻中OsEXPB2基因可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)以影響植株根系的發(fā)育。本研究的結(jié)果顯示,TaEXPA7-A/B/D基因的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目、葉片數(shù)目和株高均顯著高于野生型。在植物中,根系負(fù)責(zé)吸收養(yǎng)分和水分,為植株的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量并起固定和支撐地上部分的作用[14]。茂密的側(cè)根可以使植物更好地吸收營(yíng)養(yǎng),從而在一定程度上提高其對(duì)高溫、干旱等非生物脅迫的耐受性[15],因此TaEXPA7-A/B/D基因可以作為農(nóng)業(yè)分子育種的候選基因資源。也有研究表明,膨脹素基因能夠影響植物花的發(fā)育及種子的產(chǎn)量,如在紫茉莉(Mirabilisjalapa)中,不同的α-膨脹素基因分別參與了花的生長(zhǎng)、盛開和衰敗的過(guò)程[16];在煙草(Nicotianatabacum)中,過(guò)表達(dá)小麥膨脹素基因TaEXPA2不僅顯著增加了煙草種子結(jié)實(shí)量而且增加了種子的體積[17]。本研究證明了TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因?qū)M南芥花序和角果的發(fā)育均起顯著的促進(jìn)作用,表明該基因?qū)μ岣咿r(nóng)作物產(chǎn)量具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    研究表明,膨脹素基因還可以提高植物對(duì)外界非生物脅迫的耐受性,如過(guò)表達(dá)小麥膨脹素基因TaEXPB23顯著降低了轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下的失水速度[18];在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtEXPA2基因增加了植株對(duì)鹽脅迫的耐受性,而敲除該基因的突變體植株則呈現(xiàn)相反的表型[19];從冬小麥D2中分離的膨脹素基因TaEXPB7-B顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受性和存活率,且轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶的活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量與野生型相比均維持在較高水平[9]。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥植株在低溫脅迫下抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性和可溶性糖的含量均顯著高于野生型,MDA的積累量也較低,與前人研究結(jié)果一致??寡趸改軌蚣皶r(shí)清除低溫脅迫下植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的大量自由基和活性氧,對(duì)維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性起到關(guān)鍵的作用[20]??扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,對(duì)于維持低溫脅迫下植物細(xì)胞中滲透壓的穩(wěn)定具有重要作用[21]。因此,TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因可以增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受能力,但該基因影響抗氧化酶活性和相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    側(cè)根角果耐受性
    NO 誘導(dǎo)IAA 和O2·-積累于側(cè)根尖端促進(jìn)水稻側(cè)根生長(zhǎng)
    基于油菜角果長(zhǎng)度圖像識(shí)別的每角粒數(shù)測(cè)試方法
    4個(gè)地被菊新品系對(duì)濕熱脅迫的耐受性研究
    園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18
    諸葛菜角果生長(zhǎng)特性的研究
    甘藍(lán)型油菜抗裂角種質(zhì)篩選及其相關(guān)性狀分析
    種子(2017年12期)2018-01-17 10:55:45
    巴氏醋桿菌核酸修復(fù)酶UvrA對(duì)大腸桿菌耐受性的影響
    miR-29b通過(guò)靶向PI3K/Akt信號(hào)通路降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性
    阿米替林治療腦卒中后中樞痛的療效和耐受性分析
    硝態(tài)氮供應(yīng)下植物側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育的響應(yīng)機(jī)制
    不同基因型小麥側(cè)根生長(zhǎng)對(duì)硝態(tài)氮的響應(yīng)差異
    99热6这里只有精品| 长腿黑丝高跟| 岛国视频午夜一区免费看| 草草在线视频免费看| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲国产看品久久| 久久久国产欧美日韩av| 两个人免费观看高清视频| av在线播放免费不卡| 久久国产精品影院| 日本成人三级电影网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产三级在线视频| 国产三级黄色录像| 久久久久久久精品吃奶| 最近在线观看免费完整版| 久久香蕉激情| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久 成人 亚洲| 欧美国产精品va在线观看不卡| 麻豆成人av在线观看| ponron亚洲| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 日韩av在线大香蕉| tocl精华| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 老司机靠b影院| 国产又色又爽无遮挡免费看| 淫秽高清视频在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 色av中文字幕| 香蕉久久夜色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产亚洲精品av在线| 国产成人欧美| 免费在线观看完整版高清| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人手机av| 欧美一级毛片孕妇| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一区二区三区高清视频在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 很黄的视频免费| 国产1区2区3区精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 十八禁网站免费在线| 日韩大码丰满熟妇| 午夜久久久在线观看| 一本大道久久a久久精品| 波多野结衣高清无吗| 十八禁网站免费在线| 午夜免费激情av| 日本在线视频免费播放| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 亚洲国产高清在线一区二区三 | 丝袜美腿诱惑在线| 日韩大码丰满熟妇| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 嫩草影视91久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人精品久久二区二区91| 一进一出抽搐动态| 精品久久久久久久久久久久久 | 丁香欧美五月| 国产精品九九99| 亚洲五月天丁香| 亚洲成a人片在线一区二区| 我的亚洲天堂| 老司机在亚洲福利影院| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲精品色激情综合| 成人午夜高清在线视频 | 国产一级毛片七仙女欲春2 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 黄色毛片三级朝国网站| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品乱码久久久久久99久播| 99国产精品一区二区蜜桃av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美大码av| 美女国产高潮福利片在线看| 18禁观看日本| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品av久久久久免费| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品野战在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久中文字幕人妻熟女| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜久久久在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| av中文乱码字幕在线| 啦啦啦免费观看视频1| av在线天堂中文字幕| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩福利视频一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色综合婷婷激情| 国产99白浆流出| 在线视频色国产色| 久久久久久国产a免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 成人亚洲精品av一区二区| 国产1区2区3区精品| 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区三区视频了| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 哪里可以看免费的av片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级片免费观看大全| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久久久久免费视频了| www日本在线高清视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av天堂在线播放| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成在线人永久免费视频| 在线观看日韩欧美| 国产激情欧美一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 九色国产91popny在线| 麻豆成人av在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 在线观看日韩欧美| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产片内射在线| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费搜索国产男女视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产成人av激情在线播放| 国产视频一区二区在线看| 男人舔女人下体高潮全视频| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人欧美在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 自线自在国产av| 国产av在哪里看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 观看免费一级毛片| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 免费看日本二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 少妇熟女aⅴ在线视频| 最好的美女福利视频网| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| 日本三级黄在线观看| 无限看片的www在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产99白浆流出| 久久精品国产清高在天天线| svipshipincom国产片| 国产激情久久老熟女| 成人欧美大片| 亚洲熟女毛片儿| 成人三级黄色视频| 亚洲激情在线av| 精品免费久久久久久久清纯| 在线观看日韩欧美| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美日本视频| 99国产精品一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲欧美日韩无卡精品| videosex国产| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品久久视频播放| 一进一出抽搐动态| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一区福利在线观看| 日本a在线网址| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 丁香欧美五月| 国产成人精品无人区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人手机av| 国产精品,欧美在线| 两个人免费观看高清视频| 亚洲自拍偷在线| 成人三级黄色视频| 亚洲真实伦在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产三级黄色录像| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲,欧美精品.| 美女免费视频网站| 999精品在线视频| 成人av一区二区三区在线看| 超碰成人久久| av中文乱码字幕在线| 自线自在国产av| 成在线人永久免费视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产人伦9x9x在线观看| 久热爱精品视频在线9| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费人成视频x8x8入口观看| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 97碰自拍视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲av熟女| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美乱妇无乱码| 麻豆成人午夜福利视频| 黄色毛片三级朝国网站| 男女那种视频在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜精品在线福利| 精品久久久久久久末码| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 男女视频在线观看网站免费 | 成人av一区二区三区在线看| 黄色成人免费大全| 国产伦一二天堂av在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产精品久久男人天堂| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲精品一区二区www| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人18禁在线播放| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 美女扒开内裤让男人捅视频| 丁香六月欧美| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品影院久久| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产精品999在线| 免费看a级黄色片| 在线视频色国产色| 啦啦啦 在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜福利欧美成人| 色在线成人网| 丁香欧美五月| 一a级毛片在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲激情在线av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲中文av在线| 精品免费久久久久久久清纯| 少妇的丰满在线观看| 99国产精品99久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 黄色视频,在线免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产99白浆流出| 在线免费观看的www视频| 青草久久国产| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产成+人综合+亚洲专区| av天堂在线播放| 国产一区二区激情短视频| av片东京热男人的天堂| 国产v大片淫在线免费观看| svipshipincom国产片| 级片在线观看| 中文字幕高清在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 在线观看www视频免费| 最好的美女福利视频网| 91成年电影在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线观看吧| 日本一本二区三区精品| 波多野结衣高清无吗| 国产成人精品久久二区二区91| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 老熟妇仑乱视频hdxx| 51午夜福利影视在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产黄a三级三级三级人| 十分钟在线观看高清视频www| 一二三四在线观看免费中文在| 在线天堂中文资源库| 少妇的丰满在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久精品影院6| 在线观看日韩欧美| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品人妻1区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日本一本二区三区精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 大型av网站在线播放| 久久热在线av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 搡老妇女老女人老熟妇| 伦理电影免费视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品 欧美亚洲| ponron亚洲| 日本a在线网址| 九色国产91popny在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 精品国产亚洲在线| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 好男人电影高清在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 校园春色视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 村上凉子中文字幕在线| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 日韩欧美国产一区二区入口| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人18禁在线播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲国产看品久久| 国产色视频综合| 亚洲avbb在线观看| 欧美三级亚洲精品| 18禁美女被吸乳视频| 一本精品99久久精品77| 自线自在国产av| 日韩高清综合在线| 日本三级黄在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 一夜夜www| 91大片在线观看| 亚洲第一av免费看| 在线观看免费午夜福利视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜免费观看网址| 国产成人欧美在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产伦人伦偷精品视频| 麻豆一二三区av精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 国产乱人伦免费视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老司机福利观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 91麻豆av在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 青草久久国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费看十八禁软件| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费高清在线观看日韩| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产高清视频在线播放一区| www.www免费av| 一本大道久久a久久精品| 91成年电影在线观看| 久久青草综合色| 国产真人三级小视频在线观看| 一本一本综合久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲自拍偷在线| x7x7x7水蜜桃| 999久久久精品免费观看国产| 欧美黑人巨大hd| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 看免费av毛片| 在线观看一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 搞女人的毛片| 黄色视频,在线免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲五月婷婷丁香| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 日本一本二区三区精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 三级毛片av免费| 18禁观看日本| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲无线在线观看| 看免费av毛片| 精品国产美女av久久久久小说| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产91精品成人一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美日韩精品网址| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 身体一侧抽搐| 大香蕉久久成人网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 香蕉丝袜av| 国产99久久九九免费精品| 搡老岳熟女国产| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 午夜福利成人在线免费观看| 午夜影院日韩av| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 成人三级黄色视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费搜索国产男女视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美一级a爱片免费观看看 | 成人免费观看视频高清| 大型av网站在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品人妻少妇| 久久精品91无色码中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 哪里可以看免费的av片| 国产久久久一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久精品人妻少妇| 成熟少妇高潮喷水视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费观看人在逋| 国产精品一区二区精品视频观看| 禁无遮挡网站| 日本五十路高清| 色av中文字幕| 久久中文看片网| 久久 成人 亚洲| 国产黄色小视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产真实乱freesex| 色在线成人网| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av五月六月丁香网| 99在线视频只有这里精品首页| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 长腿黑丝高跟| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 人人妻人人看人人澡| 满18在线观看网站| 国产午夜福利久久久久久| 免费在线观看亚洲国产| 婷婷六月久久综合丁香| 可以在线观看毛片的网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一级黄色大片毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 夜夜夜夜夜久久久久| 草草在线视频免费看| 国产99久久九九免费精品| 免费看美女性在线毛片视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 操出白浆在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| xxx96com| 国产精品av久久久久免费| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久人人精品亚洲av| 正在播放国产对白刺激| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男女那种视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一进一出抽搐动态| 亚洲片人在线观看| 久久 成人 亚洲| 大型av网站在线播放| 身体一侧抽搐| 中出人妻视频一区二区| www.999成人在线观看| 91九色精品人成在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美中文综合在线视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人国产综合亚洲| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 日日干狠狠操夜夜爽| 老汉色∧v一级毛片| 老司机午夜福利在线观看视频| 深夜精品福利| 国产成人精品久久二区二区免费| 黄色视频,在线免费观看| 一本大道久久a久久精品| 男女之事视频高清在线观看| 国产黄片美女视频| or卡值多少钱| 免费在线观看亚洲国产| 精品卡一卡二卡四卡免费| av视频在线观看入口| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 在线观看免费日韩欧美大片| 日韩欧美 国产精品| x7x7x7水蜜桃| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲男人天堂网一区| 看黄色毛片网站| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜福利高清视频| 国产区一区二久久| 亚洲国产看品久久| 亚洲第一电影网av| 亚洲av美国av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久久午夜电影| 丁香六月欧美| 99国产综合亚洲精品| 午夜激情av网站| 久久久国产成人免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产亚洲欧美精品永久| 99re在线观看精品视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产成人系列免费观看| 日本三级黄在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 国产黄片美女视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 俺也久久电影网| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产97色在线日韩免费| www日本黄色视频网| 成人18禁在线播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲五月天丁香| 午夜两性在线视频| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色av中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产精品久久电影中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产1区2区3区精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久香蕉精品热| 麻豆成人午夜福利视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 久久久久亚洲av毛片大全| 国产久久久一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 久9热在线精品视频| 美女午夜性视频免费| 精品第一国产精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲五月色婷婷综合| 人人妻人人澡人人看| 久热这里只有精品99| 成人精品一区二区免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 岛国在线观看网站|