黃山藥總皂苷對晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)心肌老化的保護作用及機制

徐婉瑩，查志敏，馮楚炎，郭妍*

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管內(nèi)科，南京 210029, 2蘇北人民醫(yī)院老年科，江蘇 揚州 225001)

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的氨基在非酶促條件下，與還原糖經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)后重排折疊最終形成的不可逆產(chǎn)物。隨著年齡增長，AGEs在體內(nèi)的積累也越來越多，影響身體重要器官心腦腎的功能[1]。去乙?；讣易逯?，沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent mating type information regu-lation 2 homolog-3,SIRT3)被稱為“長壽蛋白”，是存在于線粒體內(nèi)的一種依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的組蛋白去乙?；?。它參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、線粒體代謝、線粒體動力學(xué)及自噬等方面，參與介導(dǎo)衰老過程，對不同病態(tài)下的心肌有保護作用。黃山藥總皂苷(total saponins of dioscorea pathaica，TSDP)是薯蕷科植物黃山藥根莖中提取物，主要成分為甾體皂苷類，具有治療心肌缺血、降血脂和抗腫瘤等作用，臨床上對于心肌缺血的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注，而它對心肌衰老的影響尚無研究。本實驗旨在研究TSDP對AGEs引起心肌細胞老化的影響，并探討涉及的通路。

1 材料與方法

1.1 材料

每次實驗需訂購出生 1～3 d SD 乳大鼠10只(南京青龍山動物養(yǎng)殖場)；共需180只乳大鼠。Ⅱ型膠原酶(Sigma公司，美國)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國)；AGEs(ab51995，abcam，美國)； 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(DCFH-DA)、SA-β-Gal染色試劑盒(上海碧云天公司)；p53,p16(Proteintech，中國)；SIRT3，超氧化物歧化酶-2 (superoxide dismutase-2,SOD2)(CST，美國)。CCK-8試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)(APExBIO，美國)；黃山藥總皂苷提取物原粉(成都地奧制藥公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞的分離與培養(yǎng) 無菌條件下取SPF級SD乳大鼠10只，剪開胸壁取出心臟，立即置于預(yù)冷的無菌PBS洗3次，剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm大小，用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化6 min×7次，每次將收集消化后液體滴入預(yù)冷的含有血清及完全培養(yǎng)基的終止液中。7次消化完畢后，將收集的溶液于4℃ 、1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后，鋪板于10 cm皿中放在37℃溫箱中，1.5 h后，收集含有心肌細胞的上清，吹勻后鋪板于6孔板中，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實驗分組與干預(yù) 不同濃度(0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，8.0，10.0 μg/ml)的TSDP處理細胞48 h，觀察細胞活性，于時間梯度(0、6、12、24、36、48 h)干預(yù)細胞，檢測細胞活性及蛋白水平。

實驗分組：將培養(yǎng)48 h的原代心肌細胞分為以下5組(每組設(shè)6個復(fù)孔)：不干預(yù)的對照組，AGEs組(100 ng/ml)，TSDP + AGEs組(10 μg/ml TSDP處理細胞2 h后，加入100 ng/ml AGEs),TSDP組(2 μg/ml)，TSDP組(10 μg/ml)。每組處理48 h。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力 將原代心肌細胞鋪于96孔板培養(yǎng)48 h后換液，加入不同濃度TSDP(0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，8.0，10.0 ng/ml)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)6個復(fù)孔。棄培養(yǎng)基，每孔加入含10%WST-8的培養(yǎng)基100 μl，37℃孵箱避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀測450 nm波長處的吸光度(A450 nm)，心肌細胞活力=(A450 nm實驗組-A450 nm空白組)/(A450 nm對照組-A450 nm空白組)×100%。

1.2.4 測定SA-β-Gal活性 藥物干預(yù)細胞48 h后，棄細胞培養(yǎng)基，加入1 ml染色固定液每孔，室溫下15 min。棄固定液，PBS洗3次，吸除PBS，每孔加入1 ml染色工作液，用保鮮膜包裹后放入無CO2孵箱過夜。光學(xué)顯微鏡觀察，計數(shù)。

1.2.5 細胞內(nèi)活性氧測定 將孔板中的培養(yǎng)基吸除，避光加入稀釋好的DCFH-DA1 ml(10 μmol/ml)。細胞培養(yǎng)箱中靜置20 min，用DMEM洗3次，于熒光顯微鏡下觀察，用Image J 測熒光強度。

1.2.6 Western-blotting檢測蛋白水平 用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)提取心肌蛋白。用BCA法測蛋白濃度。配制12%的分離膠及6%的濃縮膠，80 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍達到分離膠底部。100 V 1 h轉(zhuǎn)膜，4℃下牛奶封閉2 h。加入一抗β-actin、SOD、p53、p16、SIRT3(1∶1 000)，4℃過夜。次日洗膜后加入二抗，4℃孵育2 h，洗膜，用 ECL 試劑盒化學(xué)發(fā)光，顯示目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TSDP對心肌細胞活性的影響

48 h內(nèi)干預(yù)對心肌細胞活性影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。干預(yù)48 h，TSDP濃度<10 μg/ml的藥物劑量同未加藥干預(yù)組的細胞活性差別無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)。說明<10 μg/ml以內(nèi)可作為藥物的安全劑量范圍，最終選取TSDP濃度為2 μg/ml及10 μg/ml的藥物干預(yù)細胞。

圖1 不同濃度及時間TSDP對心肌細胞活性的影響

2.2 TSDP時間梯度對衰老指標(biāo)的影響

TSDP(10 μg/ml)干預(yù)細胞24、36、48 h后，p53水平下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)，干預(yù)36、48 h時，p16減少顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 不同時間對衰老指標(biāo)的影響

2.3 TSDP時間梯度對SOD2和SIRT3蛋白水平的影響

干預(yù)6、12、24、36、48 h時， SIRT3蛋白水平較未干預(yù)組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。干預(yù)12、24、36、48 h時，SOD2蛋白水平較未干預(yù)組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。

圖3 不同時間對SIRT3及SOD2蛋白水平的影響

2.4 TSDP對心肌細胞老化的影響

與空白對照組比較，AGEs組SA-β-Gal活性增加，p53和p16蛋白水平增加。TSDP(10 μg/ml)預(yù)先加入AGEs干預(yù)的心肌細胞后，AGEs引起的SA-β-Gal增強及p53和p16蛋白水平增加均得到了緩解(P<0.05, 圖4)。

圖4 TSDP對AGEs引起的心肌細胞老化的影響

2.5 TSDP對SIRT3蛋白水平的影響

與空白對照組比較，AGEs組SIRT3蛋白水平下降。TSDP(10 μg/ml)干預(yù)心肌細胞后，SIRT3增加。TSDP(10 μg/ml)預(yù)處理AGEs干預(yù)的心肌細胞后， SIRT3蛋白水平較AGEs組升高(圖5，P<0.05)。

圖5 TSDP對 AGEs干預(yù)后的心肌細胞SIRT3蛋白水平的影響

2.6 TSDP對 AGEs 引起的 ROS 變化的影響

與對照組相比，AGEs組 ROS增加，SOD蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TSDP(10 μg/ml)預(yù)先加入AGEs干預(yù)的心肌細胞后，AGEs引起的ROS增強及SOD蛋白水平的減少均得到了緩解(P<0.05，圖6)。

圖6 不同處理組心肌細胞中 ROS 和SOD的水平

3 討 論

研究衰老機制，尋找抗衰老方法一直是人類想攻克的難題。在眾多衰老學(xué)說中，糖基化致衰老學(xué)說引起越來越多研究者的重視。晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs是還原糖的羧基與大分子物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等的氨基結(jié)合后經(jīng)過重排脫水等反應(yīng)形成的不可逆產(chǎn)物。AGEs的積累激活炎癥信號通路，引起活性氧產(chǎn)生，影響心腦腎功能，繼而加速衰老[1,2]。體內(nèi)實驗也證明，人體內(nèi)存在緩慢糖基化過程。隨著年齡增長，血漿及各組織中的AGEs水平逐步增高。SA-β-Gal是細胞老化過程中最常用的生物標(biāo)志物，p53增加與細胞增殖抑制密切相關(guān)，p16通過抑制細胞分裂周期關(guān)鍵酶活性使G1細胞周期停滯，兩者也被認為是老化的標(biāo)志。我們的前期研究結(jié)果表明，AGEs干預(yù)后SA-β-Gal活性明顯增強， p16、p53蛋白水平顯著升高，活性氧ROS產(chǎn)生明顯增加[3]。如何改善AGEs引起的老化引起越來越多研究者們的關(guān)注。

黃山藥為我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物，有效成分為甾體總皂苷。以其為主要成分的國家級中藥地奧心血康具有明顯活血化淤、改善機體微循環(huán)、擴張冠狀動脈血管、改善心肌缺血、降低血脂的作用[4]，在臨床上廣泛用于心肌缺血性疾病的治療，它的抗損傷的分子機制主要涉及增加了SOD2的表達、降低氧化應(yīng)激水平、降低心肌細胞的凋亡率、抑制炎癥因子的生成、改善微循環(huán)等[5]。因而我們思考TSDP可能對 AGEs通過氧化應(yīng)激引起的心肌細胞老化有著保護作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSDP減少了AGEs干預(yù)后SA-β-Gal的活性增加及p53，p16蛋白水平的增加，由此推測TSDP對AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞的衰老起保護作用。

我們的實驗探討了上述過程中可能涉及的機制。去乙?；讣易鍖S護心臟功能穩(wěn)態(tài)、老化、疾病及代謝等多方面有重要的作用。而其中沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT3在長壽人群中表達量高，又被稱為長壽蛋白。它是一種存在于線粒體內(nèi)NAD依賴的去乙酰化酶，通過參與能量代謝、清除活性氧、參與調(diào)節(jié)細胞凋亡與生長、細胞內(nèi)自噬等對不同病態(tài)下的心肌細胞具有保護作用。隨著年齡的增長,心肌細胞 SIRT3水平逐漸降低。敲除 SIRT3 或表達下降與衰老導(dǎo)致代謝異常的心肌疾病如心臟疾病、糖尿病、高血壓等的發(fā)生相關(guān)[6,7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，AGEs干預(yù)內(nèi)皮祖細胞后降低了SIRT3表達，而過表達SIRT3保護了AGEs誘導(dǎo)的EPCs功能障礙和增強的抗氧化能力[8]。椎間盤退行性病變時，AGEs在髓核細胞中積累，而過表達SIRT3減輕了髓核細胞的氧化應(yīng)激和凋亡進而預(yù)防AGEs誘導(dǎo)的椎間盤退行性病變[9]。本次試驗證實了AGEs干預(yù)原代心肌細胞后， SIRT3的表達下降。我們推測心肌細胞中AGEs所致衰老可能與SIRT3的減少有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)富含SIRT3激活劑的食物可改善機體代謝，姜黃素具有心臟保護和抗衰老特性[10]。白藜蘆醇通過激活SIRT3改善糖尿病性心肌病[11]。所以，增加SIRT3的活性可能是減輕心臟衰老影響的潛在策略。本實驗中，TSDP干預(yù)心肌細胞后增加了SIRT3及抗氧化酶SOD2的蛋白水平。同時TSDP增加了AGEs引起的SIRT3蛋白水平和SOD2蛋白水平的下降。

許多研究已證明，過表達SIRT3可以增加SOD2和過氧化氫酶CAT的表達，進而對抗由ROS誘導(dǎo)的細胞氧化損傷[12]。ROS在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，是造成心肌細胞損傷加重和患者死亡的重要因素。它的產(chǎn)生和細胞對其解毒能力之間的不平衡擾亂了細胞還原環(huán)境，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。低ROS水平通過誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的防御機制，繼而提高抗壓能力，有助延長壽命。高ROS水平導(dǎo)致適應(yīng)不良，導(dǎo)致衰老的發(fā)生和發(fā)展[13]。AGEs被認為是一個重要的促進ROS產(chǎn)生和造成氧化應(yīng)激、繼而引發(fā)心肌損傷的因素[14]。我們前期研究也證明了AGEs增加了心肌ROS產(chǎn)生，促進心肌衰老。SOD2活性的高低可間接反應(yīng)細胞清除氧自由基的能力，及時清除ROS保護內(nèi)環(huán)境至關(guān)重要。熱量限制可通過激活SIRT3，進而去乙?；?SOD2，減少氧化應(yīng)激[15]。在本次試驗中，AGEs減少了SOD2蛋白水平的表達，增加了ROS產(chǎn)生。預(yù)先干預(yù)TSDP后，AGEs引起的ROS增強及SOD2蛋白水平減少均得到了緩解。因此，我們推測TSDP可能通過增加SIRT3，進而增加SOD2的水平，對 AGEs通過氧化應(yīng)激引起的心肌細胞老化起到保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，TSDP可改善AGEs引起的心肌細胞衰老現(xiàn)象，為祖國傳統(tǒng)藥物干預(yù)老化治療提供了理論依據(jù)。其作用機制可能與升高SIRT3、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有關(guān)。但其中具體作用機制及其他信號通路仍需進一步研究。