Omi/HtrA2基因過(guò)表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定

霍雨艷 饒冬梅

摘 要

目的：構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的-Omi/HtrA2基因融合表達(dá)載體，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的影響奠定基礎(chǔ)。方法：PCR擴(kuò)增HtrA2基因編碼框，用KpnI和BamHI將TS- HtrA2及目的載體pEC3.1（+）兩步法雙酶切，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建基因重組載體radE5- HtrA2，包裝重組腺病毒，RT-PCR 檢測(cè)重組腺病毒基因mRNA的表達(dá)并提取蛋白進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。結(jié)果：重組真核表達(dá)載體radE5- HtrA2經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶分析，雙酶切之后的條帶與理論值相符，測(cè)序結(jié)果未見(jiàn)堿基變異，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，可測(cè)到目標(biāo)條帶。結(jié)論：成功構(gòu)建了基因重組載體radE5- HtrA2，并能在結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中正常表達(dá)，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

omi/HtrA2;結(jié)腸癌;重組質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染

中圖分類(lèi)號(hào)： R735.35 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.084

0 前言

絲氨酸蛋白酶Omi又稱(chēng)Htr A2，在機(jī)體各組織器官中普遍表達(dá)，并在細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體中與多種底物蛋白發(fā)生反應(yīng)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后關(guān)系密切[2]。Omii通過(guò)其IAP結(jié)合位點(diǎn)與IAPs的BIR域結(jié)合，以便使已結(jié)合caspase的BIR域釋放caspase，使其恢復(fù)活性而使細(xì)胞凋亡[3]。本研究通過(guò)構(gòu)建Omi表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中，檢測(cè)其表達(dá)情況，為后續(xù)研究該基因高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HT29細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（GibcoBRL）+10%滅活胎牛血清（FBS）（Gibco）+雙抗（青霉素100U/ml+鏈霉素100ug/ml）的培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)條件，用25cm2的組織培養(yǎng)瓶單層培養(yǎng)，并定期用1%胰酶-EDTA溶液分離細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例1：2～1：3。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料試劑與儀器設(shè)備

HT29細(xì)胞（佳木斯大學(xué)友情提供），DMEM（GibcoBRL），10%滅活胎牛血清（FBS）（Gibco），雙抗（Sigma），胰酶（Sigma），PBS（Sigma），熒光顯微鏡（OLYMPUS ），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO），低速離心機(jī)（TD5A- WS式），Adenovirus Expression System重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)（genesil），T4 DNA Ligase及部分內(nèi)切酶（NEB公司），部分內(nèi)切酶（Takara），HEK 293（美國(guó)ATCC），質(zhì)粒提取試劑盒（維特潔），PCR儀（ABI）。

1.3 HtrA2基因表達(dá)載體構(gòu)建

1.3.1 PCR擴(kuò)增HtrA2基因

引物對(duì)：HtrA2-f：5'-GG GGTACC acccctgacctccgg-3'K pnI ?HtrA2-r：5'-GG GATCC GGCAGCTCATTTTC--3'EcoRI，Product：Length=2006bp;模板：pX-CMV- HtrA2載體;循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94℃ 5min，變性94℃ 20s，退火58℃ 25s，延伸72℃ 2min 30 cycles，72℃ 3min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 連接PCR產(chǎn)物至T（中間過(guò)渡）載體

反應(yīng)體系：Pmd-19T simple vector 0.5μl，HtrA2 （PCR產(chǎn)物） 4.5μl，Ligation Mixture 5μl，16℃，過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取克隆進(jìn)行BamHI，KpnI雙酶切鑒定。

1.3.3 亞克隆HtrA2至穿梭載體pEC3.1（+）

用KpnI和BamHI將TS- HtrA2及目的載體pEC3.1（+）兩步法雙酶切，然后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物命名為pEC3.1-HtrA2（見(jiàn)圖1），載體結(jié)構(gòu)：---attL1—CMV—HtrA2—IRES---EGF P—stop---attL2-連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取克隆進(jìn)行鑒定。

1.3.4 通過(guò)LR體外同源重組將HtrA2表達(dá)框轉(zhuǎn)移至pGSad eno（radE5）腺病毒（見(jiàn)圖2）表達(dá)載體上

（1）LR體外同源重組：將它命名為radE5- HtrA2。

（2）蛋白酶K消化重組酶，加入1μL蛋白酶K，37℃反應(yīng)15min。

（3）將5μL上步反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5а，涂布于含Ampr抗性（終濃度為100μg/ml）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。從每個(gè)培養(yǎng)皿上各挑取3個(gè)單克隆菌落接種于50ml含Ampr抗性（終濃度為100ug/ml）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床（250rpm）培養(yǎng)過(guò)夜。

（4）用中提試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.4 包裝重組腺病毒

（1）準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染的線(xiàn)性化腺病毒DNA

用PacI酶切重組腺病毒質(zhì)粒;酚：氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀。

（2）將PacI線(xiàn)性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HT29

（3）培養(yǎng)的HT29，出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞進(jìn)行裂解收病毒，裂解上清感染HT29。

（4）放大培養(yǎng)重組腺病毒

當(dāng)細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞進(jìn)行裂解，收病毒于1 ml 無(wú)菌PBS中。

（5）腺病毒radE5-HTRA2感染HT29細(xì)胞

感染前一天接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，第二天細(xì)胞量達(dá)到70%-80%密度;感染前將細(xì)胞更換培養(yǎng)基為無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM，將病毒放在冰盒上慢慢融化，按確定的最適體積加入細(xì)胞中，分別設(shè)MOI=0.1、MOI=1、MOI=10、MOI=100、MOI=500組輕輕混勻，5% CO2 ?37℃ Incubator中培養(yǎng)過(guò)夜。觀察感染病毒后熒光表達(dá)，計(jì)數(shù)熒光百分率，細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后24h、72h、96h收集細(xì)胞樣品進(jìn)行RT-PCR和Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增HtrA2基因凝膠電泳結(jié)果

目的基因長(zhǎng)度：2006bp，由下圖可見(jiàn)，擴(kuò)增的基因?yàn)槟康幕颉＃ㄒ?jiàn)圖1）

2.2 連接PCR產(chǎn)物至T載體進(jìn)行酶切鑒定結(jié)果

由圖2看出克隆1，克隆2，克隆3均為正確條帶，小條帶大小為1Kbp，選取克隆1（TS-HtrA2）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的HtrA2片段有一堿基突變，但不影響氨基酸序列，故可以此克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 亞克隆HtrA2至穿梭載體pEC3.1（+）后酶切鑒定

BamH，KpnI雙酶切鑒定結(jié)果如下（見(jiàn)圖3）（應(yīng)該切出一約2Kbp的條帶），圖片可見(jiàn)克隆①②均為正確克隆，命名為pEC3.1-HtrA2。

2.4 PI-SceI/I-CeuI雙酶切radE5-HtrA2電泳

通過(guò)LR體外同源重組將HtrA2表達(dá)框轉(zhuǎn)移至pGSadeno腺病毒表達(dá)載體（radE5）上，PI-SceI/I-CeuI雙酶切radE5-Htr A2電泳圖譜（見(jiàn)圖4），酶切分析：正確的克隆將切出一條3kb的小條帶，且大帶大于15kb（說(shuō)明載體為腺病毒載體），由圖4可知目的克隆是正確的，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 RT-PCR測(cè)定HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達(dá)良好（見(jiàn)圖5）。

2.6 Western檢測(cè)HtrA2重組腺病毒基因蛋白表達(dá)

Western-blot 檢測(cè)rAdE5-HTRA2感染HT29細(xì)胞后蛋白表達(dá)良好（見(jiàn)圖6）。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性消化道疾病，近幾年在國(guó)內(nèi)發(fā)病率逐年升高。結(jié)腸癌患者生存率偏低，治療效果及預(yù)后均較差，嚴(yán)重影響健康[4]。目前臨床上治療結(jié)腸癌主要以手術(shù)為主，早期可通過(guò)手術(shù)切除進(jìn)行根治，但大部分結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，常規(guī)手術(shù)無(wú)法根治，因此尋找新的治療手段具有重要意義[5-6]。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，包括癌基因和抑癌基因的表達(dá)[7-9]。

絲氨酸蛋白酶Omi，隸屬于Htr A（High Temperature Req uirement A）家族，又稱(chēng)Htr A2，在機(jī)體各組織器官中普遍表達(dá)，并在細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體中與多種底物蛋白發(fā)生反應(yīng)。Omi/Htr A2作為促凋亡蛋白，可降解細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡抑制蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Omi可通過(guò)與線(xiàn)粒體的抗凋亡蛋白HAX-1相互作用，使HAX-1降解，從而增加細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性[10-12]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外構(gòu)建Omi基因表達(dá)重組載體radE5- HtrA2，轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中并能正常表達(dá)，為后續(xù)研究Omi/HtrA2基因過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及結(jié)腸癌的臨床治療提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Ding Y1，Wang B1，Chen X1，Zhou Y1，Ge J1 ?Staurosporine suppresses survival of HepG2 cancer cells through Omi/HtrA2-mediated inhibition of PI3K/Akt signaling pathway.Tumour Biol.2017 Mar;39（3）：1010428317694317.

[2]Wang K1，Yuan Y2，Liu X1，Lau WB2，Zuo L3，Wang X3，Ma L1，Jiao K1，Shang J1，Wang W1，Ma X1，2，4，Liu H1，4.Cardiac Specific Overexpression of Mitochondrial Omi/HtrA2 Induces Myocardial Apoptosis and Cardiac Dysfunction. Sci Rep.？2016 Dec 7;6：37927.

[3]Xu Z1，Chen Y1，Xu G1，Peng C2，Liu E2，Li Y2，Niu J2，Li C3.Omi/HtrA2 pro-apoptotic marker differs in various hepatocellular carcinoma cell lines owing to ped/pea-15 expression level. Oncol Rep.？2015 Feb;33（2）：905-12.

[4]張玥，石菊芳，黃慧瑤，等.中國(guó)人群結(jié)直腸癌疾病負(fù)擔(dān)分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2015，36（7）;709-714.

[5]程雪，紀(jì)捷，張靜敏，等，Lgr5蛋白和Her-2蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2017，45（1）：17-22.

[6]王勇，傅贊，封益飛，等.腹腔鏡完整結(jié)腸系膜切除（CME）治療局部晚期右半結(jié)腸癌的臨床療效[J].中國(guó)地方病雜志，2016（11）：1302-1303.

[7]王千里.結(jié)腸癌組織NPRL2表達(dá)及其臨床意義研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2014.

[8]耿樂(lè)樂(lè)，陳彥平.Omi/HtrA2 及其在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2015，37（16）： 2507-2509.

[9]饒冬梅.Omi/HtrA2表達(dá)與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（8）：1239-1242.

[10]鄭亞萍，劉春杰.Raf1基因重組腺病毒SIRNA載體構(gòu)建及其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響[J].中國(guó)比較學(xué)雜志，2016，26（4）：18-23.

[11]曾萍，楊簡(jiǎn)，楊俊等.大鼠CD47 RNAi 腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J].臨床心血管病雜志，2019，33（9）：892-895.

[12]LUO T，LIU G，LONG M，et al.Treatment of cadmumrinduced renal oxidative damage in rats by admin-stration of alpha lipoic acid J.Environ Sci Pollut ResInt，2017，24（2）：183218.