氫氣影響大鼠神經(jīng)興奮傳導(dǎo)的研究

張曉康, 儀楊, 謝飛, 張昭, 馬勝男, 趙鵬翔, 馬雪梅

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124

氫氣(H2)具有重要的生物學(xué)功能。1975年，Dole等[1]的研究表明，連續(xù)14 d在8.106×105Pa條件下吸入2.5% O2和97.5% H2的混合氣體能夠治療小鼠皮膚鱗狀細胞癌。隨后在多個缺血再灌注造成組織或器官嚴重損傷的模型中發(fā)現(xiàn)，氫氣能夠減少氧化應(yīng)激、消除炎癥、降低凋亡，發(fā)揮著顯著的保護治療作用[2-3]。大量的研究先后證明氫氣對逾百種疾病具有潛在治療作用，如各類缺血再灌注損傷、動脈硬化、糖尿病、急慢性炎癥等[4-6]。

目前，對于氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用的機理一直存在爭議，主要有兩種假說：一是被廣泛接受的氫氣選擇性清除毒性自由基的假說；二是生物酶假說，即氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用可能主要是多靶點基于酶學(xué)反應(yīng)的過程，細胞膜的氧化還原酶類及離子通道等都受到氫氣的調(diào)節(jié)[7]。氫氣作為理想的選擇性抗氧化劑，目前對其神經(jīng)功能調(diào)節(jié)作用的研究較多，如治療神經(jīng)退行性疾病、緩解毒癮戒斷癥狀和抗焦慮抑郁等[8-11]。用富氫水灌胃3個月能夠改善阿爾默茨海默癥轉(zhuǎn)基因模型雌性小鼠的認知行為[8]；帕金森病人在連續(xù)飲用富氫水48周后能夠明顯提高帕金森評分，表明氫氣能夠改善帕金森病的影響[11]。研究還發(fā)現(xiàn)，氫氣生理鹽水注射能預(yù)防小鼠嗎啡成癮戒斷癥狀，提示了氫氣或許能減少戒毒痛苦，協(xié)助戒毒，而氫氣在腦中的抗氧化作用可能是氫氣輔助戒毒的作用機制[9]。2019年Mizuno等[10]招募志愿者，通過K6評分、血液生化指標的檢測，測驗氫氣對正常人體的情緒、焦慮、神經(jīng)自主行為和日常生活動的影響，結(jié)果表明富氫水能夠降低焦慮、抑郁和神經(jīng)自主功能，對神經(jīng)興奮具有一定的抑制作用而對于血壓等生理指標沒有影響。此外，飲用富氫水可以改善有機磷農(nóng)藥誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷，提高乙酰膽堿酯酶活性[12]。以上研究表明，氫氣對神經(jīng)功能具有調(diào)節(jié)作用，但對上述結(jié)果的分析多數(shù)是從氫氣的選擇性抗氧化推測，氫氣對神經(jīng)細胞的興奮傳導(dǎo)功能是否有影響還沒有相關(guān)研究。

膜片鉗技術(shù)利用玻璃微電極與細胞膜進行封接，對細胞膜表面的離子通道的離子電流和電導(dǎo)等參數(shù)進行記錄和分析，在神經(jīng)系統(tǒng)功能研究和藥物研究等生理功能研究中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[13]。動作電位是神經(jīng)或者心肌細胞等可興奮細胞受到刺激信號時在靜息條件下的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的可擴布的電位變化過程，動作電位過程中包含著鈉、鉀、鈣和氯離子等的轉(zhuǎn)運和相應(yīng)的離子通道的開閉，并且在不同的可興奮細胞具有特征性的動作電位[14-16]。因此，研究神經(jīng)細胞動作電位的變化是研究神經(jīng)功能變化的最直接方式[17]。

本研究通過腦片膜片鉗技術(shù)分別測定氫氣作用于大鼠大腦切片皮層神經(jīng)細胞和飲用富氫水(8周)大鼠大腦切片皮層神經(jīng)細胞的動作電位，并利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph massspectrometer，LCMS)研究飲用富氫水8周后的大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，初步分析氫氣影響神經(jīng)興奮傳導(dǎo)的機制，旨在闡述氫氣對神經(jīng)損傷保護功能和對神經(jīng)功能調(diào)節(jié)功能的可能作用機制，以期為氫氣對神經(jīng)相關(guān)疾病的治療提供出發(fā)點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

大鼠(Rattusnorregicus)購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。富氫水購買自北京活力氫源飲品有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

人工腦脊液配制：124 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1KCl、1.2 mmol·L-1NaH2PO4、24 mmol·L-1NaHCO3、12.5 mmol·L-1D-葡萄糖、2 mmol·L-1CaCl2、1.5 mmol·L-1MgSO4，pH 7.3。

電極內(nèi)液配制：140 mmol·L-1葡萄糖酸鉀，2 mmol·L-1MgCl2，8 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1HEPES，0.2 mmol·L-1NaGTP，2 mmol·L-1Na2ATP，pH 7.3。

膜片鉗玻璃電極電阻為4～6 mΩ，由硼硅酸鹽玻璃毛細管(GB 150F-86-10，美國Sutter instrument公司)拉制;Axopatch 700B(美國Molecular Devices公司)；VT1000 S震動切片機(德國Leica公司)。

1.2 膜片鉗測定氫直接作用大腦皮層動作電位

1.2.1大鼠腦片制備 大鼠用烏拉坦(25%，1 mL·100 g-1)深度麻醉，斷頭后迅速從顱腔取出大腦。將大腦移至冰冷的人工腦脊液中冷卻。隨后用502膠將大腦粘于標本底座，將標本底座固定于盛有冰冷人工腦脊液的標本槽內(nèi)，再用震動切片機將大腦組織橫切，厚度為300 μm。制備的腦片轉(zhuǎn)移至含有飽和95% O2和5% CO2混合氣體的人工腦脊液孵育槽中，室溫孵育至少1 h，備用。

1.2.2膜片鉗測定腦片動作電位 分2瓶人工腦脊液置于37 ℃恒溫水浴鍋中，其中一瓶預(yù)先0.5 h通入等流速的氧氣、二氧化碳和氫氣至飽和并持續(xù)通入，另一瓶預(yù)先0.5 h通入等流速的氧氣和二氧化碳至飽和并持續(xù)通入。將制備好的大鼠腦切片放置在記錄槽內(nèi)，記錄槽中溫度為(31±1) ℃，蠕動泵恒定速度灌流，速度為2 mL·min-1。記錄槽管路首先通入充滿飽和氧氣和二氧化碳的人工腦脊液，膜片鉗使用玻璃電極與大腦皮層區(qū)細胞進行封接，在全細胞模式下記錄動作電位，刺激電流從-60 pA到500 pA(刺激時間500 ms，間隔5 s)，以20 pA增長。之后，500 pA 500 ms激發(fā)刺激動作電位。最后，-20 pA 800 ms刺激激發(fā)超極化。結(jié)果為對照組數(shù)據(jù)(CTL)。完成后切換記錄槽管路持續(xù)通入充飽和氧氣、二氧化碳和氫氣的人工腦脊液，記錄槽溫度、膜片鉗參數(shù)設(shè)定不變，膜片鉗在全細胞模式下記錄大腦皮層動作電位，結(jié)果為氫氣組(H2)數(shù)據(jù)。離子電流信號通過Axopatch 700B放大，pClamp10.6軟件用于記錄采集。

1.3 膜片鉗測定飲用富氫水8周的大鼠大腦皮層動作電位變化

1.3.1大鼠8周飲用富氫水干預(yù) 4周齡大鼠隨機分成2組，每組8只，富氫水組(H2)每日提供飲用飽和富氫水2次，每次1 h(8:00—9:00，17:00—18:00)，對照組(CTL)同樣時間飲用去離子水，其余時間禁水，共處理8周。

1.3.2大鼠腦片制備 經(jīng)過8周處理的大鼠采用1.2.1中的方法制備大鼠腦片。

1.3.3膜片鉗測定腦片動作電位 人工腦脊液置于37 ℃恒溫水浴鍋中，預(yù)先0.5 h通入等流速的氧氣和二氧化碳至飽和并持續(xù)通入。將制備好的大鼠腦切片放置在記錄槽內(nèi)。記錄槽管路通入充滿飽和氧氣和二氧化碳的人工腦脊液，膜片鉗使用玻璃電極與大腦皮層區(qū)細胞進行封接，在全細胞模式下記錄動作電位，記錄槽溫度、流速和膜片鉗參數(shù)設(shè)定與1.2.2相同。

1.4 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

色譜條件參照趙芳等[18]的研究。取大鼠大腦皮層精密稱重，置入2 mL離心管中，按1∶9的比例加入混合溶劑(甲醇∶乙腈為1∶1，體積分數(shù))，冰水浴快速勻漿，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析大腦皮層中谷氨酸(glutamate，Glu)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用pClamp10.6軟件記錄的動作電位原始數(shù)據(jù)和離線分析動作電位參數(shù)為：靜息膜電位(Vm)，閾值電流(rheobase)，閾值電壓(threshold)，峰高(peak amplitude)，半峰寬(halfwidth)，動作電位間隔(inter spike interval)，爆發(fā)頻率(number of action potential)，快后超級化電位(fAHP)，慢后超級化電位(sAHP)，輸入抗阻(Rin)。利用Graphpad prism 7進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。統(tǒng)計采用非配對t-test和配對t-test，若P<0.05，即認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫瞬時作用對大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞動作電位的影響

氫氣對神經(jīng)功能具有一定的影響，為了分析氫氣是如何影響神經(jīng)細胞的功能，采用膜片鉗技術(shù)來研究氫氣是否調(diào)節(jié)神經(jīng)的興奮傳導(dǎo)功能。如圖1所示，大腦皮層神經(jīng)細胞爆發(fā)動作電位的閾值電壓顯著升高(P=0.029 2)，表明神經(jīng)細胞爆發(fā)動作電位需要更高的能量，并且動作電位間隔顯著延長(P=0.030 9)，這2個因素表明神經(jīng)細胞爆發(fā)動作電位的頻率出現(xiàn)了降低趨勢，氫氣對神經(jīng)興奮具有一定的抑制作用。此外，神經(jīng)細胞的輸入抗阻顯著降低(P=0.035 1),表明氫氣處理過的神經(jīng)細胞興奮性出現(xiàn)了明顯的降低。神經(jīng)細胞在不同電流刺激條件下氫氣處理組(H2)動作電位出現(xiàn)次數(shù)明顯的少于對照組(CTL)，也表明氫氣直接作用于神經(jīng)細胞降低了神經(jīng)的興奮性。同時，神經(jīng)細胞的靜息膜電位出現(xiàn)升高趨勢(P=0.098 7)，這暗示氫氣可能通過改變細胞膜內(nèi)外電位或者離子通道等的變化實現(xiàn)對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響。

注：*—氫氣處理組(H2)和對照組(CTL)間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 飲用富氫水8周對大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞動作電位的影響

為了進一步驗證相對長時間的氫處理是否能夠改變腦神經(jīng)細胞的興奮性，采用4周齡大鼠連續(xù)飲用富氫水8周后，取對照組(CTL)和飲用富氫水組(H2)大鼠制備腦片，采用膜片鉗技術(shù)記錄對照組(CTL)和飲用富氫水組(H2)大腦皮層神經(jīng)細胞的爆發(fā)動作電位情況。如圖2所示，飲用富氫水組(H2)大鼠動作電位在不同電流刺激下同樣出現(xiàn)了次數(shù)明顯降低，表明在大鼠在8周相對較長的時間內(nèi)富氫水干預(yù)同樣降低了神經(jīng)的興奮性。皮層神經(jīng)細胞的閾值電流(P=0.537 8)和動作電位間隔(P=0.385 5)具有升高趨勢，表明飲用富氫水使大鼠的大腦皮層神經(jīng)細胞在一定程度上升高了動作電位出現(xiàn)所需要的能量，進而降低了神經(jīng)細胞的興奮性。

圖2 飲用富氫水8周對大腦皮層神經(jīng)細胞興奮傳導(dǎo)的影響Fig.2 Effect of drinking hydrogen for eight weeks on excitatory conduction of cortical nerve cells

2.3 飲用富氫水8周對大鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

為了驗證飲用富氫水8周后大鼠皮層神經(jīng)細胞出現(xiàn)神經(jīng)興奮降低是否是由氫影響神經(jīng)細胞合成神經(jīng)遞質(zhì)含量變化所導(dǎo)致，采用LCMS檢測飲用富氫水8周后皮層區(qū)細胞神經(jīng)遞質(zhì)含量。如圖3所示，與CTL組相比，富氫水組(H2)大鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)(P=0.600 9)、γ-氨基丁酸(GABA)(P=0.713 1)和乙酰膽堿(Ach)(P=0.854 1)呈下降趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；去甲腎上腺素(NE)(P=0.940 1)未出現(xiàn)明顯的變化。結(jié)果表明，氫氣降低皮層神經(jīng)細胞的興奮性的作用不是通過改變神經(jīng)遞質(zhì)的合成量來實現(xiàn)的。

圖3 飲用富氫水8周對大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of drinking hydrogen for eight weeks on excitatory conduction of cortical nerve cells

3 討論

氫氣是一種具有重要生物學(xué)功能的分子，在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、腦缺血再灌注損傷等的治療中具有明顯的效果[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)氫氣直接作用于神經(jīng)細胞顯著升高了閾值電壓、延長動作電位間隔并顯著降低了輸入抗阻，并且在不同電流刺激下動作電位頻率明顯下降，表明氫氣直接作用于神經(jīng)細胞能夠降低興奮傳導(dǎo)。在富氫水干預(yù)8周的大鼠皮層神經(jīng)細胞在動作電位的閾值電壓、動作電位間隔和輸入抗阻等并沒有顯著性差異，但是同樣出現(xiàn)了不同電流刺激下動作電位頻率明顯下降。然而，進一步LCMS檢測結(jié)果表明，皮層神經(jīng)遞質(zhì)含量并未出現(xiàn)顯著性變化，表明氫氣可能是直接作用于神經(jīng)膜上離子通道或者膜內(nèi)外電壓差。

目前，對于氫氣對神經(jīng)功能的作用機制知之甚少，已報道的文章中介紹了氫氣對神經(jīng)細胞具有明顯保護或者調(diào)節(jié)等功能，推測氫氣發(fā)揮功能的原因是氫氣的選擇性抗氧化等[21]，但是并未解釋清楚氫氣是如何發(fā)揮作用，因此在本研究中通過膜片鉗技術(shù)直接檢測神經(jīng)細胞動作電位的變化，來分析神經(jīng)細胞功能的變化。

本研究腦片膜片鉗的結(jié)果顯示，氫氣處理組與對照組相比大鼠皮層神經(jīng)細胞的閾值電壓、動作電位間隔和輸入抗阻具有顯著性差異(P<0.05)，氫氣處理組靜息膜電位升高，神經(jīng)細胞爆發(fā)動作電位的電壓閾值升高，表明氫氣可能對神經(jīng)細胞膜離子通道的開放和關(guān)閉有影響，很有可能是通過改變細胞內(nèi)外電荷差異變化或者直接作用于細胞的膜表面的離子通道來實現(xiàn)對神經(jīng)細胞興奮性的調(diào)節(jié)。神經(jīng)組織在紊亂狀態(tài)下的異常放電和神經(jīng)損傷的過程中伴隨著離子的異常流動和分布，氫氣對神經(jīng)細胞的細胞膜表面離子通道或者膜電位的調(diào)節(jié)作用，可能是氫氣緩解成癮戒斷癥狀、抗焦慮抑郁和改善睡眠的可能原因[9-10]。這為氫氣治療焦慮、癲癇和戒毒等神經(jīng)興奮相關(guān)疾病提供了依據(jù)。

在靜息條件下，維持細胞膜兩側(cè)的離子差主要依靠離子泵鈉離子、鈣離子、氯離子的主動轉(zhuǎn)運運輸功能，其中鈉-鉀泵將鉀離子運輸至胞內(nèi)，將鈉離子運出胞外，維持外正內(nèi)負的電位差，是維持靜息膜電位主要作用[17]。本研究中，氫氣瞬時作用升高了靜息膜電位，很可能和鈉-鉀泵有關(guān)。而在神經(jīng)細胞靜息電位的基礎(chǔ)上產(chǎn)生動作電位的過程中，伴隨著多種離子通道的開閉和離子的轉(zhuǎn)運。在去極化、復(fù)極化和后電位過程中主要包含著鈉離子通道、鉀離子通道開放和關(guān)閉[15]。本研究中，氫氣處理組和富氫水組的動作電位次數(shù)均明顯少于對照組，進一步說明氫氣能夠起到抑制神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)的功能可能和鈉離子通道、鉀離子通道存在作用關(guān)系。此外，GABA受體和甘氨酸受體是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的2種配體門控氯離子通道，起到對神經(jīng)興奮的抑制作用[22]。本研究中，LCMS檢測結(jié)果表明，富氫水組的GABA相對含量略低于對照組，因此，氯離子通道也可能是氫氣發(fā)揮抑制性作用的位點。

值得注意的是，本研究中，飲用飽和富氫水8周大鼠的大腦切片在動作電位指標中出現(xiàn)了抑制趨勢，但神經(jīng)遞質(zhì)含量未發(fā)生顯著性變化。這可能是因為富氫水在制備飽和后會在10 min中內(nèi)迅速揮發(fā)，在室溫常壓條件下15 min將至飽和濃度一半左右，約400 μmol·L-1，進而導(dǎo)致飲用富氫水作用相對不顯著。因此在后續(xù)研究中，可將飲用富氫水代替為吸入固定濃度的氫氣，保證氫氣的充分作用。此外，本研究證明氫氣對神經(jīng)興奮的抑制作用可能是通過影響離子通道，因此，下一步研究將通過膜片鉗技術(shù)獨立研究氫氣對鈉、鉀和氯離子通道的影響。