宣肺通腑方加減對腸缺血/再灌注肺損傷導(dǎo)致的急性肺損傷大鼠抗炎、抗氧化作用?

劉美秀 馮高華 嚴(yán)正平 梁小紅

（江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 張家港 215600）

急性肺損傷是危重患者死亡的常見原因，也是危重患者常見的臨床癥狀，主要的臨床表現(xiàn)是呼吸衰竭和頑固性低氧血癥［1］。急性肺損傷主要的發(fā)病機(jī)制是多種炎性細(xì)胞以及其釋放的炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致肺泡腔滲出液體、肺微血管通透性增高，進(jìn)一步導(dǎo)致非心源性肺水腫［2］。肺是機(jī)體內(nèi)含氧量最為豐富的器官，當(dāng)急性肺損傷發(fā)生時，炎癥所引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞的破壞，使肺通氣的換氣功能受到影響，肺組織的細(xì)胞氧分壓會降低，使機(jī)體啟動低氧反應(yīng)［3］。腸缺血/再灌注損傷不僅能導(dǎo)致腸道毒素和細(xì)菌的移位，還能釋放多種腸道氧自由基及炎癥因子，造成多種器官功能損傷和全身炎癥反應(yīng)，其最為明顯的是肺損傷［4-5］。宣肺通腑方出自《溫病條辨》，具有宣肺通腑、清瀉熱結(jié)的功效。本實(shí)驗(yàn)將研究宣肺通腑方加減對腸缺血/再灌注肺損傷導(dǎo)致的急性肺損傷模型大鼠的抗炎、抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取40只清潔級SD大鼠，周齡6～8周，平均（6.90±0.62）周，體質(zhì)量200～230 g，平均（215.41±20.60）g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供，動物許可證號：SCXK（蘇）2013-0016。

1.2 試藥與儀器 宣肺通腑方，組方：生石膏45 g（先煎），杏仁20 g，知母30 g，大黃10 g，赤芍15 g，瓜蔞30 g，蒼術(shù)20 g，前胡10 g，蘆根30 g，柴胡10 g。水煎后藥液離心處理，取出雜質(zhì)，濃縮至生藥含量1 g/mL的水煎液，高溫殺菌，4℃保存?zhèn)溆?。地塞米松（上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司）；酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RSE3020動物肺功能儀器（北京貝蘭博科技有限公司）；一抗、二抗（兔抗人，武漢博士德生物工程公司）。

1.3 模型制備［6］模型組、地塞米松組、宣肺通腑方組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉后，消毒鋪巾，正中切口進(jìn)入腹部，將腸系膜上動脈分離。用無損傷的動脈夾夾閉腸系膜上動脈的根部，阻斷30 min后，將動脈夾移開恢復(fù)腸道血流。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為缺血處腸系膜微動脈消失，且再灌注前的腸道腫脹、瘀黑，動脈夾移開后缺血處腸系膜微動脈恢復(fù)搏動。假手術(shù)組僅分離腸系膜上動脈但不夾閉。腹腔內(nèi)給予含有160 U的慶大霉素9 g/L、生理鹽水0.1 mL，縫合腹膜、肌肉及皮膚。再灌注2 h后斷頸處死，留取肺標(biāo)本待檢測。

1.4 分組與給藥 將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、地塞米松組、宣肺通腑方組，每組各10只。地塞米松組在建模1 h前腹腔注射5 mg/kg地塞米松。宣肺通腑方組在建模3 d前開始灌胃宣肺通腑方水煎液，每日1次，每次7.5 g/kg。正常組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃。

1.5 肺功能檢測 于給藥前和造模后，采用RSE3020動物肺功能儀器及AniRes 2005軟件分析系統(tǒng)共同測量FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC值。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）肺組織病理學(xué)觀察。取石蠟包埋的肺組織標(biāo)本，10%甲醛固定，切片，常規(guī)脫蠟，HE染色。采用雙盲法在光鏡下觀察病理學(xué)變化。2）白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平。3）超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮合酶（NOS）及髓過氧化物酶（MPO）含量檢測。取100 mg肺組織，加入2 mL的勻漿介質(zhì)液配置成5%的肺組織勻漿，進(jìn)行SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量檢測。3）Western blotting檢測p38、p-p38及p-NF-κB蛋白。將細(xì)胞消化吹打后轉(zhuǎn)移至離心管離心，倒去上清，加1 mL PBS打勻，移入EP管，12 000 r/min離心2 min，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)的蛋白提取，BCA法分析蛋白定量。制備50 μg的蛋白樣品，上樣后SDS-PAGE電泳，通過蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%脫脂奶粉TBST中，封閉避光1 h，洗滌后加入一抗稀釋溶液（p38、p-p38及p-NF-κB 1∶1 000比例稀釋），4℃環(huán)境下過夜保存，洗滌之后加入二抗溶液（p38、p-p38及p-NF-κB 1∶5 000比例稀釋），孵育1 h后再次洗滌，加入ECL發(fā)光液，使用NIH Image software軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較實(shí)施獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用F值檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平升高，宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，?P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，○P<0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組宣肺通腑方組n 10 10 10 10 FVC（%）94.76±7.64 99.47±8.13*97.26±7.81*#93.13±6.73*#○TLC（L）94.53±7.43 101.42±9.46*98.29±8.49*#93.34±6.41*#○FEV1（L）96.67±7.83 112.41±9.24*99.16±7.91*#95.21±7.06*#○FEV1/FVC（%）97.61±9.46 120.26±11.43*103.46±10.53*#90.37±8.49*#○

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察 見圖1。假手術(shù)組未見明顯的病理改變，肺組織結(jié)構(gòu)正常，偶見滲出物及炎性細(xì)胞；模型組有大量的炎性細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)滲出物明顯；地塞米松組改變輕于宣肺通腑方組，宣肺通腑方組可見明顯病理改變，有輕度的滲出物及炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比較見表2。與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組及宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平升高（P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低（P<0.05）；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低（P<0.05）。

表2 各組大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比較（±s）

表2 各組大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組宣肺通腑方組n 10 10 10 10 IL-8（ng/L）52.49±12.18 114.38±19.14*84.29±10.48*#60.54±10.07*#○TNF-α（pg/mL）15.47±3.54 86.24±14.35*70.27±12.49*#40.24±7.26*#○IL-6（ng/L）34.73±10.42 88.49±13.26*71.49±9.41*#40.37±7.57*#○VEGF（ng/L）78.61±8.45 153.18±21.44*91.16±15.53*#80.15±12.49*#○

2.4 各組大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比較見表3。與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組及宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平降低，NOS、MPO水平升高（P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低（P<0.05）；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比較（±s）

表3 各組大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組宣肺通腑方組n 10 10 10 10 SOD（NU/mg）201.24±21.76 71.43±10.64*93.78±11.35*#171.29±17.49*#○GSH-Px（U/mg）49.16±6.73 24.67±4.51*32.43±4.06*#44.34±5.62*#○NOS（U/mg）7.62±1.13 12.63±1.76*11.86±1.34*#8.73±0.93*#○MPO（U/g）1.37±0.16 2.43±0.21*2.21±0.18*#1.78±0.12*#○

2.5 各組大鼠p38/NF-κB蛋白表達(dá)比較 見表4，圖2。與假手術(shù)比較，模型組、地塞米松組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量升高，宣肺通腑方組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量降低（P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低（P<0.05）；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低（P<0.05）。

表4 各組大鼠p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組宣肺通腑方組n 10 10 10 10 p38 0.81±0.26 0.91±0.29*0.83±0.25*#0.71±0.18*#○p-p38 0.93±0.29 1.13±0.31*1.01±0.30*#0.82±0.26*#○p-NF-κB 0.86±0.23 1.02±0.33*0.94±0.28*#0.73±0.21*#○

圖2 各組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表達(dá)

3 討 論

急性肺損傷是各種間接及直接致傷因素所導(dǎo)致的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性的肺泡和肺間質(zhì)水腫，所引起的急性低氧性呼吸功能不全。主要病理生理特征是通氣/血流比例失調(diào)、肺容積減少、肺順應(yīng)性降低［7-8］。腸缺血/再灌注后肺損傷的主要原因是過度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。腸缺血/再灌注后氧自由基會過度增加，可以隨血液播散全身，激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致臟器功能損傷［9］。

肺功能是呼吸系統(tǒng)疾病的必要檢測，主要檢測肺容量大小、呼吸道的通暢程度，對檢出肺、氣道病變，評估病情嚴(yán)重程度及預(yù)后，鑒別呼吸困難原因，評定治療方法等有重要的臨床價值［10-11］。本文研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平升高，宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低。說明宣肺通腑方可以降低FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平。IL-8可以調(diào)節(jié)人類生殖生理和病理過程，其作用機(jī)制是與特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其作用［12］。TNF-α是能夠抑制刺激破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的細(xì)胞因子，由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［13］。IL-6是一種細(xì)胞因子，能夠參與并刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞分化、增殖且提高其功能［14］。VEGF是一種促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，具有高度的特異性，還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、血管通透性增加等作用［15］。研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組及宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平升高；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低。說明宣肺通腑方可以使IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低。宣肺通腑方改善肺功能可能與方劑所含的藥物或成分有關(guān)，如吳躍文等［16］報(bào)道，增加麻杏石甘湯中的石膏比例，能明顯改善患者的肺功能，緩解咳嗽、咯痰、氣喘癥狀，縮短肺部啰音消失時間。王瑞成等［17］認(rèn)為知母-黃柏藥對的30%醇洗物通過抑制NF-κB 信號通路，可降低 LPS誘導(dǎo)的 IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。大黃素是大黃的主要有效成分，潘書涵等［18］認(rèn)為其抗炎的機(jī)制可能是抑制TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信號通路開放。

SOD是一種抗氧化金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成過氧化氫和氧，在機(jī)體抗氧化與氧化平衡中起到關(guān)鍵作用，與很多疾病的發(fā)生密不可分［19］。GSH-Px是一種過氧化物分界酶，能夠使有毒的過氧化物還原成無氧的羥基化合物，起到保護(hù)細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)不受過氧化物的損害和干擾［20］。NOS存在于巨噬細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，具有與原生膜聯(lián)合和協(xié)助細(xì)胞通訊的功能［21］。MPO是一種重要的含鐵溶酶體，能夠?qū)е聜€體對疾病易感性的差異，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［22］。本文研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、地塞米松組及宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平降低，NOS、MPO水平升高；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低。說明宣肺通腑方可升高SOD、GSH-Px水平，降低NOS、MPO水平。類似的研究，如裴晶等［23］證實(shí)石膏通過升高SOD活力到抗氧化作用。本文研究顯示，與假手術(shù)比較，模型組、地塞米松組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量升高，宣肺通腑方組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量降低；與模型組比較，地塞米松組、宣肺通腑方組p38、pp38及p-NF-κB蛋白降低；與地塞米松組比較，宣肺通腑方組p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低。說明宣肺通腑方可使p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低。韓正貴等［24］研究顯示，宣肺通腑方對肺損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制能夠降低p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表達(dá)。孫月雯等［25］認(rèn)為大黃牡丹湯可通過調(diào)控TLR/MyD88/NF-κB-p65信號治療急危重癥患者急性腸功能障礙。張銀環(huán)等［26］研究發(fā)現(xiàn)大黃素可劑量依賴誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積與炎癥損傷，進(jìn)而損傷細(xì)胞，該過程與調(diào)整p-NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)宣肺通腑方發(fā)揮療效與該方的有效成分緊密相關(guān)。

綜上所述，宣肺通腑方加減對腸缺血/再灌注肺損傷導(dǎo)致的急性肺損傷大鼠作用明顯，能有效改善大鼠肺功能，通過調(diào)控p38/NF-κB通路，降低IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF而發(fā)揮抗炎作用，提高SOD、GSH-Px水平，降低NOS、MPO水平，起到抗氧化作用和治療急性肺損傷的效果。