腦泰通方對(duì)糖尿病合并出血性腦卒中大鼠血清IL-1、ICAM-1的影響?

謝 軍 李 軍

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000）

腦出血是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，具有極高的致殘率、發(fā)病率、死亡率，糖尿病作為其中的危險(xiǎn)因素，在腦出血期間病情往往更加嚴(yán)重。糖尿病患者合并急性腦出血往往病死率高，康復(fù)過程延緩，預(yù)后差，中醫(yī)藥在此病的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，受到臨床工作者的關(guān)注。本文作者李軍教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用腦泰通方加減治療糖尿病合并腦出血的患者，能夠有效改善肢體活動(dòng)障礙等后遺癥，且大多數(shù)患者都收到良好的療效。本研究采用腦泰通方治療糖尿病腦出血大鼠，觀察大鼠的神經(jīng)功能改善、相關(guān)炎性因子的改變，探討其發(fā)病及治療機(jī)制，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Ⅰ級(jí)SD大鼠96只，雌雄各半，體質(zhì)量（280±20）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCGY（川）2015-030，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飲食、水，及時(shí)更換墊料，營造良好的生活環(huán)境。為防止鼠類交配，注意將雌雄大鼠隔開安置。

1.2 試藥與儀器

腦泰通方，組成：丹參15 g，姜半夏12 g，淡竹茹10 g，炒枳實(shí)10 g，桔梗12 g，茯苓12 g，廣陳皮12 g，水蛭 6 g，地龍 10 g，菖蒲 12 g，蟬蛻 10 g，龍腦 0.1 g（沖服）。藥材制成含生藥2 g/mL的濃縮水煎劑（陜西中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心提供，批號(hào)20181023）。轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（深圳永年科技有限公司）；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)（北京亞泰科隆電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（北京亞泰科隆電子儀器有限公司）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（北京亞泰科隆電子儀器有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-TekELXSOSIU）；高速冷凍離心機(jī)（日本日立CR22GII）；腦立體定位儀（美國stoeting公司）；微量注射器（上海醫(yī)學(xué)儀器廠）；牙科鉆（深圳瑞沃德有限公司）；白細(xì)胞介素-1（IL-1）試劑盒（成都旭海潤東生物科技有限公司，批號(hào)20180126542）；細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）試劑盒（成都旭海潤東生物科技有限公司，批號(hào)2018042305）。

1.3 模型制備

1.3.1 糖尿病大鼠模型 參照STZ［1］誘導(dǎo)法，采用高能量飲食喂養(yǎng)（標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇）［2］，空腹12 h后，腹腔注射50 mg/kg STZ，注射STZ后2 d，再測(cè)空腹12 h的血糖，首次和3 d后兩次隨機(jī)血糖均≥16.7 mmol/L，即為造模成功［3］。

1.3.2 腦出血模型 用10%水合氯醛按0.4 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉糖尿病模型大鼠。剃刀清理頭部毛發(fā)，然后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，因鼠尾堅(jiān)硬，不易分離，可先用溫水提前浸泡下，充血后手術(shù)刀劃開縱行小口，剝離韌帶，用微量注射器快速取血約55 μL，即包扎開始固定。固定時(shí)應(yīng)該注意正確的固定順序是：先定耳間線，再定門齒。耳朵和眼睛之間，酒精消毒手術(shù)刀切開十字切口找到前囟（約1 cm），使前后囟保持一條直線，提前查找相關(guān)的動(dòng)物腦立體定位圖（坐標(biāo)：前囟前0.25 mm，右旁開3.45 mm，深度6 mm），記號(hào)筆在手術(shù)點(diǎn)標(biāo)記“十”字符號(hào)，即為鉆孔處，使用微型電動(dòng)顱鉆（鉆頭尖端直徑1 mm），右手持鉆，務(wù)必用左手托扶右手，因大鼠顱骨較薄，易鉆透，深度以到骨膜為好，邊鉆邊觀察，適當(dāng)情況下用針頭探下，手下稍有落空感表明已經(jīng)鉆透。將取完血的微量注射器固定于定位儀上，注射時(shí)不宜過快，以10 μL/min速率均勻注射20 μL，留針5 min，再以同速注射剩存的35 μL。完成后，針頭靜置5 min后遲緩?fù)酸?。退針后，針孔用無菌骨蠟封閉，確認(rèn)無出血后，碘酒消毒縫合大鼠頭部皮膚，使用青霉素噴于手術(shù)部位防止感染，并將大鼠置于恒溫墊上復(fù)蘇，恒溫墊溫度維持37℃，待蘇醒后放回籠子。

1.4 分組及用藥

采用隨機(jī)法將大鼠均分為4組，即空白組、假手術(shù)組、模型組、腦泰通方組。造模成功24 h后開始給藥?？瞻捉M、假手術(shù)組及模型組灌胃生理鹽水2 mL/100 g，腦泰通方灌胃藥液2 mL/100 g，每日早晚2次，持續(xù)1周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

大鼠蘇醒后，各組分別在6 h、24 h、3 d、7 d取6只大鼠，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及采血檢測(cè)。1）神經(jīng)功能缺損程度。大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Bederson［4］法，總分0～4分，數(shù)值越高，缺損功能越嚴(yán)重。2）各組大鼠血清中IL-1、ICAM-1含量。術(shù)前禁食12～24 h，用新鮮配制的10%水合氯醛麻醉各組大鼠（按0.4 mL/100 g注射量），固定四肢于手術(shù)臺(tái)，消毒手術(shù)處，于前胸剪開，充分暴露胸腔腹腔，剝離器仔細(xì)剝離血管神經(jīng)，找到腹主動(dòng)脈，采血針垂直進(jìn)針，止血鉗夾血流上源，將采血針末端插入真空管，松止血鉗，采集后及時(shí)夾閉腹主動(dòng)脈下端，EP管置于恒溫水浴鍋37℃待離心，全部取血完畢后，取血管放置3 000 r/min的離心機(jī)中，10 min離心完畢后移液槍取上清液至50 mL EP管，并將其放置-80℃冰箱中冷凍，待測(cè)。將ICAM-1、IL-1抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或者樣本，其中的ICAM-1、IL-1連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后徹底洗滌后加入ICAM-1、IL-1抗體，將未結(jié)合的生物素抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ICAM-1、IL-1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模情況

造模全部結(jié)束后，依據(jù)Bederson評(píng)分，剔除3只，不計(jì)入本實(shí)驗(yàn)。術(shù)前死亡2只，因麻醉操作不妥或過多致死；術(shù)中死亡7只，因術(shù)中顱腦鉆操作不妥，致失血過多致死；術(shù)后死亡5只，因傷口裂開、同類撕咬、或傳染致死。實(shí)驗(yàn)中96只大鼠，均分為4組，每組24只，因造模等各種情況損失的大鼠，自動(dòng)由空白大鼠補(bǔ)充，保證各組數(shù)量相同。

2.2 各組大鼠一般狀況

同一批號(hào)的大鼠購進(jìn)時(shí)，活動(dòng)自如，屈伸有力，反應(yīng)迅速，毛色亮白，飲食無異常。特殊飼料喂養(yǎng)后，大鼠體質(zhì)量明顯增加，喜靜惡動(dòng)，毛色淡黃，糞便臭穢黏滯，STZ注射后1周，大鼠“三多”癥狀表現(xiàn)顯著，體質(zhì)量有所降低，出現(xiàn)皮毛色澤晦暗無光澤，目光呆滯，爬行無力等癥狀。行腦出血造模后，左側(cè)后肢體癱軟，左前肢抬舉無力，不能直線，呈轉(zhuǎn)圈狀態(tài)，行動(dòng)遲緩，不能攀爬，舌質(zhì)紫黯，舌下紫脹瘀點(diǎn)、瘀斑。連續(xù)灌胃7 d后，給藥組大鼠精神活躍，毛色漸見光澤，進(jìn)食尿量均有所減少，體質(zhì)量略有回升，活動(dòng)度好轉(zhuǎn)，左前爪彎曲，偶有抓須動(dòng)作，左后肢無力有所改善，輕微屈曲移動(dòng)，舌質(zhì)紫黯，翻舌底瘀青、瘀斑，較服藥前改善。

2.3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

見表1。與模型組比較，在6 h與12 h假手術(shù)組評(píng)分明顯降低（P<0.01），可能因?yàn)樾g(shù)中創(chuàng)傷、麻醉過多導(dǎo)致。模型組、腦泰通方與空白組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；假手術(shù)組與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；模型組與腦泰通方組在各時(shí)間段均有明顯差異（P<0.05）。

表1 各組大鼠Bederson評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠Bederson評(píng)分比較（分，±s）

與模型組比較，?P<0.05，??P<0.01；與空白組比較，△P<0.01。下同

組別空白組假手術(shù)組模型組腦泰通方組n 24 24 24 24 6 h 0.00±0.00**0.81±0.40**2.53±0.23△2.02±0.42*△24 h 0.00±0.00**0.81±0.40**2.73±0.23△2.22±0.62*△3 d 0.00±0.00**0.00±0.00**2.84±0.23△2.18±0.42*△7 d 0.00±0.00**0.00±0.00**2.62±0.23△2.11±0.41*△

2.4 各組大鼠血清中IL-1含量比較

見表2。空白組與假手術(shù)組較無明顯差異（P>0.05）；模型組與空白組均有顯著差異（P<0.01），提示造模成功；腦泰通方組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示用藥后對(duì)于IL-1水平有降低作用。

表2 各組大鼠不同時(shí)間段血清中IL-1水平比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間段血清中IL-1水平比較（ng/L，±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組腦泰通方組n 24 24 24 24 6 h 67.62±9.32**68.56±10.21**86.32±7.47 80.21±5.42*△24 h 67.62±8.32**68.86±9.31**94.56±9.48 85.24±7.71*△3 d 67.63±11.96**66.87±8.56**99.24±7.25 92.46±10.54*△7 d 66.53±8.35**67.21±11.87**97.56±6.14 91.32±7.69*△

2.5 各組大鼠血清中ICAM-1含量比較

見表3?？瞻捉M與假手術(shù)組比較，無明顯差異（P>0.05）；模型組與空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功；模型組與腦泰通方組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），提示腦泰通方對(duì)于ICAM-1具有降低作用。

表3 各組大鼠不同時(shí)間段血清中ICAM-1含量比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠不同時(shí)間段血清中ICAM-1含量比較（ng/L，±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組腦泰通方組n 24 24 24 24 6 h 34.92±7.10**35.10±4.25**67.89±7.24 59.62±8.54*△24 h 34.92±7.10**35.11±8.26**86.46±10.54 80.21±11.20*△3 d 34.92±6.97**35.16±3.47**98.24±9.25 93.64±9.56*△7 d 34.92±7.10**35.14±9.10**98.26±13.10 91.24±7.56*△

3 討論

對(duì)于腦出血的治療，本文作者李軍提出了“痰瘀學(xué)說”，在此病治療上引出了很好的辨證思路，強(qiáng)調(diào)“瘀血阻滯，脈道不利”［5］。中醫(yī)認(rèn)為［6］瘀血既為腦出血之病理基礎(chǔ)，又為腦出血之病理產(chǎn)物，腦出血急性期應(yīng)給予活血化瘀治療。“瘀血不去則新血不生”，祛瘀血能減少對(duì)腦髓的壓迫，促進(jìn)腦髓功能的恢復(fù)，防止痰濁、水腫、毒邪等對(duì)腦髓造成損傷，使被壓迫的腦絡(luò)氣血運(yùn)行正常，挽救受損的腦髓。李軍教授將痰瘀學(xué)說結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究，創(chuàng)立腦泰通方，其中丹參、姜半夏為君，祛瘀生新，燥濕化痰，兩者合用滌痰祛瘀之功倍增。陳皮、半夏相須為用，此二陳除痰飲，理中氣，兼燥濕，體現(xiàn)氣順痰消之機(jī)要；竹茹清熱化痰和胃，助君藥之效；桔梗宣肺化痰，載藥上行頭目；枳實(shí)辛散苦降，配以桔梗一升一降，調(diào)達(dá)氣機(jī)，相得益彰；茯苓淡脾利濕，使下行有路、水蛭破血逐瘀；地龍通絡(luò)，去頑痰，合用助滌痰通絡(luò)之力，以石菖蒲、蟬蛻為佐，芳香醒神，開竅啟閉；蟬蛻輕開散上，相輔相成，開竅之功增強(qiáng)。冰片為使藥，引諸藥上行達(dá)腦，使血脈暢達(dá)?，F(xiàn)代藥理也為中藥治療提供了理論依據(jù)。臨床上采用丹參川芎嗪注射液聯(lián)合黃芪治療糖尿病腦功能減退的患者，大多數(shù)都收到了良效［7］。結(jié)果表明，丹參提取物具有促進(jìn)血液循環(huán)的作用，可通過清除血管中的代謝廢物以及血管壁上的脂質(zhì)沉積，改變血液通暢度［8］，對(duì)于腦缺血損傷、腦組織微循環(huán)起到保護(hù)和修復(fù)作用。水蛭是活血化瘀方案常用的藥物。有研究證實(shí)［9］，水蛭活性成分含有的凝血酶抑制成分可能具有阻止凝血酶誘發(fā)腦水腫的形成的作用。水蛭配合丹參，共同參與改善血流變學(xué)，同時(shí)對(duì)于炎癥通路中的各類因子均有拮抗的作用，還作為血管的清道夫，清除血管中的免疫復(fù)合物，間接保護(hù)血管。陳皮含有多糖成分，可雙向調(diào)節(jié)糖脂代謝、阻止脂肪肝進(jìn)一步的加重，且具有抗氧化、清除自由基作用，可以調(diào)控平衡性激素的含量，從而調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)抵抗?jié)摿Γ?0］。臨床研究證明［11］，石菖蒲在改善記憶功能方面，常與遠(yuǎn)志配合作為對(duì)藥，發(fā)揮出“1+1>2”的效果，通過加強(qiáng)神經(jīng)突觸，增強(qiáng)AchE活性，使得大鼠在水迷宮項(xiàng)目中有良好的記憶功能體現(xiàn)。同時(shí)結(jié)果表明［12］，冰片對(duì)腦外傷大鼠腦組織有保護(hù)，促進(jìn)血腦屏障（BBB）開放。冰片常常作為促透劑，能直達(dá)病灶，這與中醫(yī)中引經(jīng)藥概念不謀而合。本研究應(yīng)用的腦泰通方多數(shù)雖為活血化瘀藥，表象看似與腦出血的治療原則相違背，但是本研究模型凝血機(jī)制正常，僅由于血管破裂，血流動(dòng)力學(xué)改變，活血藥在此促進(jìn)局部的血液循環(huán)，阻止血腫的進(jìn)一步擴(kuò)大，壓迫，促進(jìn)并建立其他的側(cè)支循環(huán)，使腫脹更好地吸收，使后遺癥能降到最小，改善神經(jīng)缺損癥狀。

王琪等［13］認(rèn)為，急性腦損傷后病理進(jìn)程與全身性抗炎反應(yīng)，包含抗炎性細(xì)胞因子的開釋密切相關(guān)。腦損傷后炎癥細(xì)胞成分的聚積可驅(qū)引炎癥前細(xì)胞因子、化學(xué)因子、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞黏附因子的表達(dá)上調(diào)［14］。有研究報(bào)道［15］，腦出血后血腫周圍腦組織以及各種特化的神經(jīng)支持細(xì)胞，產(chǎn)生釋放大量的炎性細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，加劇腦組織的水腫壓迫，導(dǎo)致周圍組織缺血缺氧、無氧代謝產(chǎn)生乳酸，堆積形成酸中毒，從而形成惡性循環(huán)。

IL-1與ICAM-1在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凝血和血小板構(gòu)成以及保持正常內(nèi)皮細(xì)胞，尤其腦外傷后的病理生理過程中都起著不可忽視的作用［16］。當(dāng)腦出血發(fā)生時(shí)，Caspase-1被激活，進(jìn)而將無活性的IL-1β前體裂解為活性形式，不僅能夠介導(dǎo)早期炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)興奮性氨基酸，造成神經(jīng)功能損傷，此外，也能造成級(jí)聯(lián)放大炎癥過程，誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)、黏附分子的產(chǎn)生［17］。當(dāng)炎癥蔓延時(shí)，ICAM-1介導(dǎo)大量白細(xì)胞趨化并聚集，其他毒性因子趨化黏附，進(jìn)一步加重腦水腫的缺氧。而內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生PG2等保護(hù)因子能力下降，血腦屏障受損，大量毒性因子進(jìn)入腦組織，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡［18-19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，糖尿病合并出血性卒中大鼠模型的左側(cè)偏癱肢體運(yùn)動(dòng)及肌力在用藥后7 d時(shí)有改善，同時(shí)血清中的IL-1、ICAM-1水平顯著降低（P<0.05）。

本研究提示腦泰通方可能通過大量活血成分改善血流動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)腦出血后血腫部位的血液循環(huán)，阻止腦水腫的進(jìn)一步擴(kuò)大、壓迫，降低血糖水平，減少炎癥通路中的各類因子對(duì)腦組織破壞，通過清除自由基及血管中的代謝廢物，保護(hù)血管，從而間接保護(hù)腦組織，改善相關(guān)的神經(jīng)缺損癥狀。