五苓散對(duì)腎陽(yáng)虛型口干燥癥小鼠頜下腺AQP-5的分布表達(dá)研究?

陳麗瑩 王潔宜 朱瀟瑩 倪哲婷 江詩(shī)夢(mèng) 王新昌

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

口干燥癥是指口腔干燥以及口腔功能的喪失，具體可由衰老、藥物使用不當(dāng)、頭頸部惡性腫瘤的放射治療以及干燥綜合征等相關(guān)因素引起。老年群體是口干燥癥的高發(fā)群體，是虛證的常見(jiàn)癥狀，陽(yáng)虛質(zhì)在老年偏頗體質(zhì)中所占比例較高［1］。中醫(yī)認(rèn)為，在老年患者群體中，陽(yáng)氣無(wú)法推動(dòng)津液在人體表里上下的輸布，可導(dǎo)致“消渴”“煩渴”等癥狀的出現(xiàn)，五苓散對(duì)治療口干燥癥頗有療效。同時(shí)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，水孔蛋白-5（AQP-5）和口干燥癥有著緊密的聯(lián)系，它是一種主要分布在唾液腺中的跨膜通道蛋白，具有水滲透性特征。正常情況下，它存在于細(xì)胞內(nèi)囊泡內(nèi)，在受到體內(nèi)外某些刺激后，出現(xiàn)由囊泡向細(xì)胞頂膜“轉(zhuǎn)位”的現(xiàn)象，從而促進(jìn)了唾液腺的正常分泌。目前尚未有關(guān)于應(yīng)用五苓散改善口干燥癥機(jī)制的研究，故本實(shí)驗(yàn)從中醫(yī)化氣布津的治則出發(fā)，假設(shè)五苓散能通過(guò)調(diào)控AQP-5分布表達(dá)治療腎陽(yáng)虛型口干燥癥小鼠，以此并展開(kāi)研究討論，為從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度解釋五苓散治療老年患者腎陽(yáng)虛型口干癥燥提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡的ICR小鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)買(mǎi)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心室，許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%。

1.2 藥物與試劑 五苓散，組方：茯苓9 g，澤瀉15 g，豬苓9 g，桂枝6 g，白術(shù)（炒）9 g。藥材購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名醫(yī)館，分2次煎煮并合并藥液，隨后將藥液稀釋成1 g/mL，4℃保存。氫化可的松注射液（5 mL∶25 mg），天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H12020886。AQP-5小鼠單克隆IgG1抗體（D-7）：sc514022，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 分組與造模 將27只ICR小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、五苓散組，每組9只。模型組、五苓散組每天按25 mg/kg肌肉注射氫化可的松，每日1次，連續(xù)10 d，自由飲水，控制飼料量為每日100～125 g/kg體質(zhì)量，連續(xù)10 d?？瞻捉M每天按0.2 mL/10 g肌肉注射生理鹽水，自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。造模后小鼠較空白組出現(xiàn)體質(zhì)量下降（P<0.05）、飲水減少（P<0.05）、精神倦怠、蜷曲拱背、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲緩、肢尾發(fā)冷、皮毛無(wú)光澤、大便稀溏等腎陽(yáng)虛表現(xiàn)，說(shuō)明造模后期小鼠“陰損及陽(yáng)”的證候改變和老年臟器衰微的氣化功能衰退，提示造模成功。

1.4 給藥方法 中藥組按照小鼠（20 g）體表面積與成人體表面積（70 kg）比計(jì)算中藥量，換算系數(shù)為0.0026，造模第11天后中藥組按照每日0.2 mL/10 g灌胃藥液，模型組和空白組按照每日0.2 mL/10 g灌胃蒸餾水。各組小鼠自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。

1.5 一般狀況觀察 1）觀察造模后小鼠精神狀態(tài)、皮毛疏松程度等現(xiàn)象。2）每日測(cè)體質(zhì)量1次，并記錄。3）每日測(cè)各組水瓶的質(zhì)量，飲水量=（后一天的飲水量-前一天的飲水量）/小鼠數(shù)量。4）測(cè)定每只小鼠唾液流量，測(cè)定前禁食1 h，不禁水。在小鼠的后頰部用鑷子放入5 mg的干燥無(wú)菌脫脂棉球，5 min后取出，電子分析天平上稱重。唾液流量（mg）=棉球濕質(zhì)量-棉球干質(zhì)量。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）頜下腺指數(shù)、病理變化。于末次給藥后次日處死小鼠，分離雙側(cè)頜下腺稱質(zhì)量，頜下腺指數(shù)（%）=頜下腺濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。頜下腺以40%的多聚甲醛固定24 h后沖洗，經(jīng)酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切成5 μm厚的薄片，HE常規(guī)染色。100倍光鏡下觀察頜下腺病理改變。2）免疫組化法檢測(cè)頜下腺AQP-5分布表達(dá)。采用免疫組化法，頜下腺蠟塊組織切片，烘烤脫蠟及過(guò)水；切片上依次滴加抗原修復(fù)液、正常山羊血清封閉液、第一抗體（稀釋濃度為1∶200）、生物素化第二抗體（IgG）、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB顯色；蘇木精復(fù)染后透明、中性樹(shù)脂封片。AQP-5陽(yáng)性顆粒DAB顯色為棕褐色及棕黃色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般狀況及頜下腺指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。與空白組比，模型組飲水量和唾液流量減少，頜下腺指數(shù)明顯下降，導(dǎo)管上皮個(gè)數(shù)明顯減少，表示頜下腺出現(xiàn)明顯萎縮，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；五苓散組較模型組飲水量和唾液流率增加，頜下腺指數(shù)上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），導(dǎo)管上皮個(gè)數(shù)有所增加（P>0.05），表示頜下腺萎縮有所緩解。

表1 各組小鼠飲水量、唾液流量、頜下腺指數(shù)、導(dǎo)管上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)比較（±s）

與空白組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別空白組模型組五苓散組n 9 9 9飲水量（mL）5.95±0.55 5.69±0.36*5.73±0.93△唾液流量（mg）23.00±1.90 4.83±1.72*15.33±1.50△頜下腺指數(shù)（%）2.87±1.76 0.38±0.05*0.47±0.06△導(dǎo)管上皮個(gè)數(shù)（個(gè)/mm2）93.35±17.18 55.37±13.47*66.52±18.03

2.2 各組小鼠頜下腺組織病理學(xué)觀察 見(jiàn)圖1?？瞻捉M腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管和毛細(xì)血管形態(tài)正常。模型組出現(xiàn)腺泡細(xì)胞萎縮、導(dǎo)管和毛細(xì)血管擴(kuò)張，纖維組織增生等。與模型組相比，五苓散組腺泡細(xì)胞萎縮、導(dǎo)管和毛細(xì)血管擴(kuò)張，纖維組織增生等表現(xiàn)減少。

圖1 各組頜下腺病理切片（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠頜下腺免疫組化AQP-5蛋白分布表達(dá) 見(jiàn)圖2?？瞻捉MAQP-5的表達(dá)分要分布在腺泡細(xì)胞的頂膜和基底膜中，在導(dǎo)管上皮中表達(dá)較少，染色顯示棕黃或棕褐色顆粒；模型組染色明顯減弱甚至消失；五苓散組可見(jiàn)中等量染色區(qū)域，較模型組染色明顯。

圖2 各組頜下腺AQP-5蛋白表達(dá)（DAB染色，100倍）

3 討 論

水孔蛋白（AQPs）在調(diào)節(jié)唾液分泌的水滲透性方面起著重要作用，可以根據(jù)滲透壓/靜水壓力梯度快速進(jìn)行水的跨膜運(yùn)動(dòng)［2］。目前已在哺乳動(dòng)物中鑒定出13個(gè)家族成員（AQP0-AQP12）。鑒于水分運(yùn)動(dòng)與唾液分泌息息相關(guān)，因此我們選擇在唾液腺中研究AQPs的表達(dá)、定位和功能。從功能上講，AQP-5似乎是迄今為止唯一一個(gè)在唾液分泌過(guò)程中發(fā)揮重要作用的AQP，主要分布在唾液腺的頂膜和基底膜中，與口干燥癥的發(fā)病有著密切聯(lián)系。AQP-5-KO小鼠是唾液腺分泌生理作用的有效模型［3］。在AQP-5-KO小鼠中，毛果蕓香堿刺激的唾液減少超過(guò)60%［4］。生理上通過(guò)下頜下腺的副交感神經(jīng)和腮腺中的交感激動(dòng)劑控制，而且自噬和溶酶體介導(dǎo)的降解以及鈣調(diào)蛋白都參與調(diào)控。在病理?xiàng)l件下，LPS在腮腺中的誘導(dǎo)導(dǎo)致NF-κB/MAPK通路被激活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1（c-Fos/c-Jun）被激活，形成與NF-κB原件結(jié)合的復(fù)合物從而下調(diào)AQP-5 mRNA的轉(zhuǎn)錄［5］。干燥綜合征（一種唾液腺功能減退，以口眼干燥為特征的自身免疫性疾?。┲卸巨A受體自身抗體導(dǎo)致毛果蕓香堿誘導(dǎo)AQP-5向頜下腺細(xì)胞頂膜的運(yùn)輸減少，表明AQP-5在毒蕈堿受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的胞吐作用中對(duì)唾液腺頂膜運(yùn)輸?shù)闹匾裕?］。益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇娇赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)AQP-5和毒蕈堿膽堿受體3（M3R）通道的作用，從而改善唾液腺的水分分布［7］。各種激動(dòng)劑對(duì)唾液分泌的刺激作用會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。在M3R中起作用的乙酰膽堿對(duì)細(xì)胞頂膜中AQP-5水平的刺激作用在衰老過(guò)程中顯著降低。在老化期間，M3R和Gq蛋白的量沒(méi)有減少，而是降低一氧化氮合酶的活性。有研究表明，口干燥癥和干燥綜合征患者AQP-5 mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯差異，主要定位于基底膜和腺泡細(xì)胞的頂膜中，但未定于導(dǎo)管細(xì)胞膜?？诟稍锇Y患者腺泡細(xì)胞頂膜AQP-5染色的強(qiáng)度高于對(duì)照組，干燥綜合征組低于口干組。AQP-3在口干患者頂膜中幾乎不表達(dá)。AQP-5和AQP-3在小唾液腺頂膜中的分布可能是區(qū)分干燥綜合征和口干患者的關(guān)鍵因素，但易受到AQP單克隆抗體差異的影響［8］?？鼘幁h(huán)衍生物SNI-2011（乙酰膽堿類(lèi)似物，可作用于M3R）誘導(dǎo)頂膜中AQP-5水平的持續(xù)增加，可能對(duì)治療與年齡相關(guān)的口干燥癥具有治療益處［9］。也有研究表明5-Aza-CdR，一種脫甲基化劑治療老年小鼠的AQP-5蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)治療和幼鼠的蛋白表達(dá)水平，因此認(rèn)為脫甲基化劑可能是恢復(fù)老年人唾液分泌的有效藥物，有利于老年口干燥癥的治療［10］?？傊?，以AQP-5為靶點(diǎn)治療干預(yù)與年齡相關(guān)的口干燥癥被認(rèn)為是有前景的策略。

在動(dòng)物模型選擇上，氫化可的松誘導(dǎo)模型是目前較為理想的腎陽(yáng)虛模型。激素的應(yīng)用可使機(jī)體在起初呈現(xiàn)煩躁多動(dòng)等陰虛表現(xiàn)，但是激素的突然停用會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸抑制狀態(tài)暴露，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激、適應(yīng)能力顯著下降，水、電解質(zhì)代謝失調(diào)，從而表現(xiàn)一系列的腎陽(yáng)虛證候，恰符合中醫(yī)所描述的“陰損及陽(yáng)”的病理過(guò)程［11-12］。不僅如此，從HPA軸指標(biāo)上看，氫化可的松模型也更符合腎陽(yáng)虛證的要求，且對(duì)腎臟無(wú)損傷［13］。同時(shí)在選擇氣虛模型上，筆者也參考了李軍蘭等［14］通過(guò)限制ICR小鼠日攝食量的方法建造氣虛證模型，以模擬老年患者臟器衰微，氣化不利的表現(xiàn)。最后，筆者采用氫化可的松誘導(dǎo)聯(lián)合限制日攝食量法建造出在氣虛基礎(chǔ)上的陽(yáng)腎虛證模型。造模結(jié)束時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)這些小鼠不但符合腎陽(yáng)虛的一系列表現(xiàn)，而且頜下腺出現(xiàn)明顯萎縮，且伴有飲水量、唾液流量減少的一系列口干癥狀，十分符合該實(shí)驗(yàn)的造模目的，提示造模成功。

五苓散出自《傷寒論》，是基于化氣布津理論，治療氣化不利，水液內(nèi)停，甚至有飲的主要方劑之一。五苓散主要用于治療水液代謝障礙性疾病，在臨床實(shí)際中水液代謝失常出現(xiàn)的少水、積水情況也屬于五苓散證。其中就包括由于腎陽(yáng)虛衰，津液輸布失常所導(dǎo)致的口干燥癥［15］?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》中強(qiáng)調(diào)“陽(yáng)化氣，陰成形”，陽(yáng)氣不足、陰氣過(guò)盛是導(dǎo)致津液輸布失司，甚至產(chǎn)生水飲的基礎(chǔ)病機(jī)。而五苓散雖多見(jiàn)利水滲濕藥，卻是以一味桂枝為主，以桂枝通陽(yáng)化氣，助津液調(diào)節(jié)，恢復(fù)津液吸收、輸布與排泄等正常功能，不僅體現(xiàn)了仲景水病重氣化的治療方法［16］，也與《溫病條辨》中所說(shuō)的“善治水者，不治水而治氣也”相一致［16］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)制作在氣虛基礎(chǔ)上的腎陽(yáng)虛模型，小鼠唾液腺體萎縮，腺體功能衰退，AQP-5的分布表達(dá)發(fā)生變化，AQP-5在頂膜的表達(dá)更弱，而在基底膜中表達(dá)為陽(yáng)性。相比較于模型組，通過(guò)五苓散干預(yù)氣虛基礎(chǔ)上的腎陽(yáng)虛模型小鼠，小鼠的飲水量、唾液流量增加，頜下腺指數(shù)升高，導(dǎo)管上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)增加，AQP-5在頂膜處染色更強(qiáng)。臨床上老年患者臟器衰微，氣化不利，陽(yáng)虛型體質(zhì)多見(jiàn)，陽(yáng)氣無(wú)以鼓動(dòng)，或因干燥綜合征使用激素，后期陰損及陽(yáng)，所以引發(fā)的口干往往是由于津液不布，而非津液虧虛。因此，筆者從化氣布津的中醫(yī)理論出發(fā)，認(rèn)為五苓散能夠通過(guò)陽(yáng)氣的溫煦、氣化及蒸騰作用，進(jìn)而調(diào)整AQP-5在頜下腺的分布表達(dá)，在一定程度上緩解口干燥癥的癥狀［17］。然而僅使用組織切片無(wú)法區(qū)別AQP-5在腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞中的運(yùn)輸，若能采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步研究AQP-5的運(yùn)輸功能，更有探索價(jià)值。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，或?yàn)橹嗅t(yī)化氣布津理論提供現(xiàn)代化的思考，也為臨床中應(yīng)用五苓散治療老年腎陽(yáng)虛型口干燥癥提供一定的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。