淋巴瘤來源外泌體的提取方法比較與鑒定

陳珍珍 謝亞萍 施鵬飛 高大泉 譚俊峰 陳況 劉利蓉 黃細(xì)蓮 徐穎 錢申賢

外泌體是幾乎所有細(xì)胞都能分泌的納米級膜狀囊泡，由脂質(zhì)雙分子層及嵌在膜上的跨膜蛋白組成，其內(nèi)包裹來源細(xì)胞的信息分子（蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等）[1]。外泌體是一個直徑在30～100 nm的異質(zhì)性群體。它作為一種自然載體，在來源細(xì)胞與靶細(xì)胞間起著信息交流的紐帶作用，能轉(zhuǎn)運(yùn)多種生物成分，如脂類、蛋白質(zhì)、RNA、miRNA、DNA片段等[2-3]。不同類型細(xì)胞來源的外泌體攜帶著特異性的標(biāo)志物，在臨床診斷、疾病篩查、疾病治療等方面具有重要作用[4]。因此，研究外泌體的組成成分及其特征對于探索腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、免疫功能障礙等疾病治療的新策略具有重要意義。但是，外泌體是一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其形成和作用機(jī)制尚存在爭議，目前仍無準(zhǔn)確、完整的定義，而提取更是復(fù)雜[5-6]。提取外泌體的方法很多，但對幾種提取方法的比較研究目前報(bào)道較少。因此，本研究對常用的3種方法以及提取到的外泌體生物學(xué)特征進(jìn)行了比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 小鼠B淋巴瘤細(xì)胞株A20、人Burkkit淋巴瘤細(xì)胞株Raji、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；人彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞株 OCI-LY3（DLBCL-nonGCB）和 SU-DHL-16（DLBCL-GCB）由浙江省中醫(yī)院顧建友教授惠贈。所用細(xì)胞株經(jīng)武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定。

1.2 試劑和儀器 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）購自美國Sigma-Aldrich公司，exoEasy試劑盒購自德國Qiagen公司，細(xì)胞裂解緩沖液購自美國Cell Signaling公司，RIPA裂解液、考馬斯亮藍(lán)快速染色液購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，二奎啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒購自中國生工生物工程（上海）有限公司，CD63、CD81、Cyto-c、ALIX、TSG101 抗體購自美國 Abcam公司。超高速離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司，一次性抽濾器（0.8 μm）購自美國Millipore公司，透射電子顯微鏡（以下簡稱電鏡）購自日本JEOL公司，凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 外泌體提取方法

1.3.1 收集細(xì)胞上清液 所有細(xì)胞株的培養(yǎng)基中加入雙抗，置于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d傳代換液。準(zhǔn)備提取細(xì)胞上清液中的外泌體時(shí)，收集處于生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，預(yù)先換用無外泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h后收集上清液。

1.3.2 PEG沉淀法提取外泌體 取細(xì)胞上清液，500 g離心5 min，去沉淀物；再2 000 g離心10 min，去細(xì)胞碎片；加入1倍體積配置的PEG，充分混勻，4℃孵育2 h；3 000g離心10 min，1 h后收集沉淀物。將沉淀物重懸于PBS中，使用略低濃度的PEG再次聚沉或通過小體系超速離心進(jìn)一步純化外泌體。

1.3.3 exoEasy試劑盒提取外泌體 取細(xì)胞上清液，先用0.8 μm孔徑的濾頭過濾，去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、凋亡小體等；再用試劑盒中溶液與細(xì)胞上清液等量上下顛倒混勻、離心過柱，用洗脫液將外泌體從柱上洗脫下來備用。

1.3.4 超速離心法提取外泌體 取細(xì)胞上清液，500 g離心5 min，去沉淀物；2 000 g離心10 min，去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；然后依次經(jīng)0.45、0.22 μm帶有聚偏二氟乙烯膜濾膜的濾頭過濾；再經(jīng)超高速離心機(jī)100 000 g、4℃離心70 min，收集沉淀物。用PBS洗滌沉淀物，120 000 g離心70 min，最后用PBS重懸沉淀物。

1.4 外泌體形態(tài)學(xué)觀察 （1）切片法：PEG沉淀法提取的外泌體用切片法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。外泌體用PBS洗滌2次，最后1次洗滌前將外泌體懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中。小心吸干上清液，沿EP管壁緩慢加入2.5%戊二醛，將樣品放入4℃冰箱固定過夜。次日用吸管吸盡樣品固定液，沿管壁小心緩慢加入1 ml PBS并漂洗樣品3次，10 min/次；再用 1%鋨酸溶液固定 1 h，PBS漂洗3次，10 min/次。隨后用5種濃度（30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇溶液依次對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度脫水15～20 min。脫水完畢吸盡乙醇，加入1 ml純丙酮處理20 min。用包埋劑和丙酮體積比1∶1的混合液處理樣品2 h。然后用純包埋劑處理樣本過夜，70℃加熱固化聚合過夜，用超薄切片機(jī)將樣品切成70～90 nm切片，用檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾和50%乙醇飽和溶液依次染色15 min。在電鏡下觀察處理好的樣品。（2）負(fù)染法：3種方法提取的外泌體均用負(fù)染法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。事先用PBS將外泌體稀釋到最佳觀察濃度，懸液滴在銅網(wǎng)上，2 min后用濾紙吸干，再滴一滴醋酸雙氧鈾到銅網(wǎng)上，負(fù)染3 min，用濾紙吸干多余液體，室溫晾干后在電鏡下觀察拍照。

1.5 外泌體蛋白表達(dá)及分布檢測 采用Western blot法。將提取的外泌體經(jīng)細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液處理，提取蛋白上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度后進(jìn)行高溫煮沸變性；變性后的蛋白經(jīng)上樣、垂直電泳，電轉(zhuǎn)移、封閉、一抗和二抗孵育，然后顯影，即得到不同蛋白表達(dá)的電泳圖。提取的外泌體經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，可得到蛋白分布圖。

2 結(jié)果

2.1 PEG沉淀法提取的外泌體形態(tài)學(xué)觀察及蛋白分布特點(diǎn) 在電鏡下，PEG沉淀法提取的外泌體負(fù)染后呈圓形或橢圓形的囊泡狀結(jié)構(gòu)，見圖1a。利用切片法處理外泌體標(biāo)本，見圖1b-d；在不同放大倍數(shù)條件下觀察到有零星散在單個分布的外泌體，但更多的是聚集成群。在電鏡下，清晰可見PEG包裹大量的外泌體進(jìn)而形成外泌體聚合物；外泌體呈現(xiàn)明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)，似茶托狀；外泌體的粒徑大小與文獻(xiàn)報(bào)道（30～150 nm）一致[8]。

在PEG沉淀法提取的A20外泌體中，Western blot法檢測到標(biāo)志性蛋白四跨膜家族成員CD63表達(dá)且較細(xì)胞中更多，同時(shí)表達(dá)CD81、熱休克蛋白HSP-70、GAPDH，但不表達(dá)胞質(zhì)蛋白Cyto-C，見圖2。這表明PEG沉淀法提取的A20外泌體內(nèi)容物符合外泌體的經(jīng)典特征。

圖1 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體形態(tài)學(xué)觀察（a：負(fù)染法，×80 000；b、c、d：切片法，放大倍數(shù)分別為11 500、20 500、44 000倍；透射電子顯微鏡）

圖2 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體表達(dá)特征性蛋白的電泳圖

由蛋白分布圖可見，細(xì)胞株的蛋白含量較外泌體豐富，外泌體大部分蛋白集中分布在55～130 kD區(qū)域，見圖3。再次使用PEG沉淀法分離提取基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640和IMDM可能存在的外泌體，同樣能觀察到類似的蛋白條帶，見圖4。圖中外泌體泳道為PEG沉淀的SU-DHL-16外泌體，與細(xì)胞泳道（SU-DHL-16細(xì)胞株全蛋白）相比，未檢測到跨膜四分子蛋白CD81、CD63的表達(dá)。

圖3 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體蛋白分布圖

2.2 exoEasy試劑盒提取的外泌體形態(tài)學(xué)觀察及蛋白分布特點(diǎn) 在電鏡下，exoEasy試劑盒提取的外泌體不易觀察到典型的膜狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑偏小，而且背景較臟，雜質(zhì)較多，視野不清晰，可見大片狀的聚合物，見圖5。

圖4 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640和IMDM可能存在的外泌體蛋白分布圖及電泳圖

圖5 exoEasy試劑盒提取多種細(xì)胞株來源的外泌體形態(tài)學(xué)觀察（a：Raji外泌體，×30 000；b：Raji外泌體，×50 000；c：HUVEC 外泌體，×20 000；d：A20 外泌體，×50 000；透射電子顯微鏡）

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，exoEasy試劑盒提取的外泌體中CD81、CD63呈弱表達(dá)。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，外泌體蛋白條帶變淡且模糊，僅見少數(shù)幾個條帶，見圖6；提示exoEasy試劑盒提取的蛋白豐度不高，雜質(zhì)偏多。

圖6 exoEasy試劑盒提取的A20外泌體蛋白分布圖及電泳圖

2.3 超速離心法提取的外泌體形態(tài)學(xué)觀察及蛋白分布特點(diǎn) 在電鏡下，可清晰觀察到多種細(xì)胞株分泌的外泌體，外泌體呈現(xiàn)經(jīng)典的茶托狀或類似球體被踩癟的形狀，粒徑約100 nm。外泌體囊泡邊緣可見雙層膜狀結(jié)構(gòu)深染；中央為均質(zhì)的淡染區(qū)，背景清晰，污染物較少；可見外泌體成團(tuán)聚集的形狀，見圖7。

圖7 超速離心法提取多種細(xì)胞株來源的外泌體形態(tài)學(xué)觀察（a、b：Raji外泌體，×50 000；c：Raji外泌體，×100 000；d：A20 外泌體，×50 000；透射電子顯微鏡）

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，超速離心法提取的外泌體中CD63、CD81呈高表達(dá)，同時(shí)還檢測到與囊泡胞吞作用或囊泡形成相關(guān)的蛋白TSG101、ALIX表達(dá)，而胞質(zhì)蛋白Cyto-C不表達(dá)，見圖8。提示該方法提取的外泌體最符合典型特征。

經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，蛋白條帶呈明顯較強(qiáng)的表達(dá)，且不同細(xì)胞株的外泌體如OCI-LY3外泌體、HUVEC外泌體有相似的蛋白特征條帶（條帶清晰），提示未受細(xì)胞培養(yǎng)基中的雜蛋白干擾，外泌體純度佳，見圖9a。

進(jìn)一步比較RIPA裂解液或與細(xì)胞裂解液處理提取的外泌體蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無明顯區(qū)別，Western blot檢測HSP-70蛋白表達(dá)也相似，而細(xì)胞裂解液處理提取的外泌體蛋白豐度相對高一些，見圖9b-c。提示在對蛋白豐度有要求的實(shí)驗(yàn)中，可選用細(xì)胞裂解液處理外泌體；對于外泌體中表達(dá)量較高的蛋白，可選用RIPA裂解液或細(xì)胞裂解液。

3 討論

淋巴瘤系淋巴組織惡性增殖性疾病，是血液系統(tǒng)中具有高度侵襲性的腫瘤。其臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，由于缺乏靈敏度高、特異性好的生物標(biāo)志物，臨床上對該疾病的診斷與治療存在較大的困難。外泌體是細(xì)胞分泌的具有獨(dú)特生物學(xué)特征的膜性小囊泡，含有大量與來源細(xì)胞密切相關(guān)的成分。外泌體起源于細(xì)胞內(nèi)的多泡體，胞膜內(nèi)陷向胞外出芽釋放形成的小囊泡[9]。由于外泌體的膜性結(jié)構(gòu)能阻止蛋白酶等對其攜帶分子的降解，所以通過對淋巴瘤來源外泌體的研究能更好地了解淋巴瘤的疾病特征，并利用外泌體特性為淋巴瘤免疫療法提供新的研究方向，以找到特異性的靶標(biāo)。然而，對外泌體的分離、提取、純化是研究的前期基礎(chǔ)。

圖9 超速離心法提取的OCI-LY3外泌體、HUVEC外泌體蛋白分布圖及2種裂解液作用的蛋白表達(dá)電泳圖（a：TEX1為OCI-LY3外泌體，TEX2為HUVEC外泌體，CELL為OCI-LY3細(xì)胞；b、c為OCI-LY3外泌體，LYSIS為細(xì)胞裂解液）

目前對于細(xì)胞培養(yǎng)上清液或體液（血液、尿液、唾液等）中外泌體成分及功能的研究越來越多，但對于分離提取純度和效率等基礎(chǔ)問題尚未得到很好的解決，且無公認(rèn)的簡便易行的技術(shù)方法?，F(xiàn)在主流的分離提取方法主要有PEG沉淀法、試劑盒提取法、超速離心法等。利用PEG純化和濃縮病毒已有50多年的歷史，是一種相當(dāng)成熟的手段[7]。基于外泌體的生物學(xué)特性與病毒相似，用PEG純化病毒的方法嘗試包裹沉淀外泌體[10]。Marton等[11]用PEG法提取了外泌體，并與其他方法提取的外泌體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同方法提取的外泌體生物學(xué)特征沒有差別，并且PEG沉淀法具有經(jīng)濟(jì)、簡便易行、產(chǎn)量高的優(yōu)勢。試劑盒提取法的應(yīng)用較多，操作簡便，對儀器設(shè)備沒有高要求，但是費(fèi)用較高。exoEasy試劑盒是利用膜的親和力特性分離外泌體，這種分離方法不是根據(jù)外泌體的大小、細(xì)胞來源的不同或外泌體表面特異性的表位，而是根據(jù)外泌體囊泡的一般生化特性，所以能很好得獲得較完整的外泌體并且快速便捷。然而，目前應(yīng)用最普遍的是超速離心法，基于外泌體的粒徑大小，通過不同的離心速度去除較小的細(xì)胞碎片和體積較大的囊泡[12-13]。超速離心法獲得的外泌體純度較高，但費(fèi)時(shí)、工作量大，效率不高。

本研究對PEG沉淀法、exoEasy試劑盒、超速離心法提取外泌體的生物學(xué)特征進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG沉淀法的提取效率最高，外泌體產(chǎn)量高，外泌體外形特征及標(biāo)志蛋白能體現(xiàn)外泌體表征。PEG沉淀法同樣提取基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640和IMDM同樣觀察到類似于外泌體的蛋白條帶，提示PEG沉淀法可能存在血清雜蛋白的污染，因此提取的外泌體純度不高。這與PEG沉淀法的原理有關(guān)，雖然PEG沉淀大大提高了外泌體的產(chǎn)量，但也增加了其他蛋白污染的可能性。PEG沉淀法的外泌體，與細(xì)胞株全蛋白的泳道CELL相比，Western blot結(jié)果顯示未檢測到跨膜四分子蛋白CD81、CD63的表達(dá)。這可能是PEG的包裹作用影響到外泌體表征的穩(wěn)定體現(xiàn)，提示PEG沉淀法可能會影響到后續(xù)外泌體的功能實(shí)驗(yàn)，PEG沉淀法提取的外泌體存在影響提取質(zhì)量的不穩(wěn)定因素。exoEasy試劑盒利用非特異性親脂性的原理，只需要較少體積的細(xì)胞上清（每次最多32 ml）就能提取到足量的外泌體，簡便易行、時(shí)效佳；但是提取到的表征不明顯，CD81、CD63的表達(dá)弱，純度低，損耗大。使用此種方法，即使在表征不明顯時(shí)，仍能觀察到外泌體表達(dá)HSP-70，提示外泌體攜帶表達(dá)HSP-70不易受干擾，且HSP-70可能在外泌體中表達(dá)量高而易被檢測到。超速離心法雖然費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率不高，但提取的外泌體表征突出明顯，純度高。因此，可以根據(jù)不同的研究目的選擇不同的提取方法。PEG沉淀法適合對外泌體產(chǎn)量需求大的實(shí)驗(yàn)，超速離心法適合外泌體的功能實(shí)驗(yàn)，試劑盒適合外泌體前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的探索使用。