TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子在小麥籽粒淀粉合成中的功能研究

高 天，徐夢軍，李鴿子，康國章,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002)

高等植物在長期進化過程中形成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)以調(diào)控逆境脅迫和物質(zhì)合成。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子約由60個氨基酸殘基組成，包含1個α-螺旋和3個反向平行β-折疊的DNA保守結(jié)構(gòu)域，β-折疊可與順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[1]。研究表明，AP2/ERF類家族轉(zhuǎn)錄因子參與了花器官發(fā)育、非生物及生物脅迫和物質(zhì)合成等過程[2-4]。

淀粉是小麥籽粒最主要的組分，約占籽粒干重的65%～80%，其含量是小麥產(chǎn)量的決定因素。目前已開展了大量有關(guān)淀粉合成相關(guān)酶基因的表達(dá)和功能研究[5]，但有關(guān)控制這些酶基因表達(dá)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未建立[6]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，水稻OsbZIP58轉(zhuǎn)錄因子與COsAGPL3、OsGBSSI(Wx)、OsSSIIa、OsSBE1、OsBEIIb和OsISA2的啟動子相結(jié)合，調(diào)控水稻籽粒淀粉的合成；Zhang等[8]、Chen等[9]、Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmaNAC36、ZmbZIP91和ZmEREB156可調(diào)控多個淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)；Li等[11]發(fā)現(xiàn)，ERF類轉(zhuǎn)錄因子ZmEREB94調(diào)控玉米籽粒淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)，參與玉米淀粉的合成。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子TaRSR1通過負(fù)向調(diào)控小麥籽粒淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響了籽粒淀粉合成。

本課題組前期研究表明，TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子參與小麥響應(yīng)干旱、冷害等非生物脅迫調(diào)控[12-13]，但該轉(zhuǎn)錄因子是否參與小麥籽粒淀粉合成尚不清楚。本研究在田間生長條件下采用BSMV-VIGS技術(shù)，以探究TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子在小麥籽粒淀粉合成中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種百農(nóng)207由河南科技學(xué)院歐行奇教授提供，2016年10月12日在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教示范園區(qū)(鄭州，34°92′ N,112°99′ E)種植，按照常規(guī)高產(chǎn)田進行種植管理。載體BSMV-α、-β和-γ由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所王道文研究員饋贈。

MulⅠ、SpeⅠ、BssHⅡ、PacⅠ和NotⅠ等限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；2×Taq Plus Master Mix購于Vazyme公司；T載體、T4 DNA ligase連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、qRT-PCR熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,Prefect Real Time)購自TaKaRa公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7)和Ribo m7G Cap Analog購于Promega公司；Trizol購自于鼎國生物有限公司；0.08 mm PVC薄膜購于上海恩爾塑業(yè)有限公司。

用Primer 5.0設(shè)計PCR引物，引物合成和基因測序均由北京六合華大基因公司完成。

1.2 BSMV-VIGS載體的構(gòu)建和病毒的產(chǎn)生

選取TaERFL1a基因CDS中非AP2/ERF保守域，但在ABD 3個拷貝同源性較高(98.4%)的一段序列，同時沉默3個拷貝而不影響其它家族成員(圖1)，片段長239 bp，用特異性引物擴增，構(gòu)建BSMV-VIGS-TaERFL1a重組載體。引物序列為：5′-CCTTAATTAAGCGGCGGCAT GCG-3′(PacI)和5′-TATGCGGCCGCCAAC GACCGACGAG-3′(NotI)，擴增產(chǎn)物純化后連入T載體(TaERFL1a-T)并測序驗證。用PacI和NotI限制性內(nèi)切酶分別酶切BSMV-γ和TaERFL1a-T載體，片段純化回收后以T4連接酶連接，構(gòu)建BSMV-VIGS-TaERFL1a沉默載體，酶切并測序驗證，載體構(gòu)建過程參考Ma等[14]的方法。以沉默報告基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)載體(BSMV-VIGS-GFP)為對照[4]。

虛線表示AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，實線表示用于VIGS沉默片段。

將BSMV-α、BSMV-β、BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP分別用限制性內(nèi)切酶MulⅠ、SpeⅠ和BssHⅡ進行充分酶切線性化，純化線性化產(chǎn)物用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄得到的RNA進行檢測，-80 ℃保存，接種前在冰上將體外轉(zhuǎn)錄的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-VIGS-TaERFL1a或BSMV-VIGS-GFP等比例混合，用DEPC處理水稀釋1倍，按照每2.5 μL混合液與45 μL FES緩沖液的比例混合生產(chǎn)BSMV病毒，用于田間摩擦接種。

1.3 TaERFL1a基因沉默小麥植株的獲得

在小麥抽穗期選取生長狀態(tài)一致的小區(qū)，構(gòu)建塑料拱棚(2.9 m寬×5 m長×1.7 m拱高)。在小麥抽穗期(2017年4月17日)選擇生長一致的50個主莖穗。接種的前1 d，塑料拱棚覆蓋PVC透明薄膜，保持適宜溫度和較高的濕度。病毒接種部位為小麥即將開花的穗部，取20 μL混合物點加在戴有乳膠手套的食指上，與拇指輕輕接觸，從穗基部直至穗尖摩擦接種，另一只手扶好第二穗基部，防止扯斷穗。接種后噴少許DEPC處理水，用保鮮膜包裹保溫保濕，1 d后取掉保鮮膜；同時，大棚覆蓋PVC薄膜，提高接種率。在接種后15 d開始每天觀察穗部以及穎殼是否出現(xiàn)病毒表型。

1.4 TaERFL1a基因沉默小麥籽粒鑒定

接種后23 d出現(xiàn)明顯病毒表型，分別取BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP浸染后有病毒表型的穗部籽粒，立即放入液氮速凍。采用Trizol法提取籽粒總RNA，參照qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法，檢測TaERFL1a基因轉(zhuǎn)錄水平。TaERFL1a基因的定量引物序列為：5′-GCCAAGGACCTCGTTAGAAAG A-3′和5′-GGCCCGTTCAGATCCAGAT-3′，擴增片段長度為 154 bp。分別以Actin(GenBank accession No.AB181991)和GAPDH(GenBank accession No.EU022331)為內(nèi)參基因，Actin引物序列為:5′-AGCGGTCGAACAACTGGTA-3′和5′-AAACGAAGGATAGCATGAGGAAGC-3′，片段擴增長度為101 bp；GAPDH引物序列為: 5′-TTTTCACCGACAAGGACA-3′和5′-AAGAGGAGCAAGGCAGTT-3′，片段擴增長度為179 bp。TaERFL1a基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt法進行計算，各樣品均進行3次生物學(xué)重復(fù)，以三次生物學(xué)重復(fù)均值表示最終結(jié)果。用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)顯著性。

接種后23 d、26 d、30 d和35 d，分別取小麥穗部及穗中部籽粒的表型進行鑒定。小麥成熟后，收獲TaERFL1a基因沉默和對照小麥的成熟籽粒，隨機取部分籽粒用于籽粒形態(tài)及淀粉相關(guān)指標(biāo)的測定。采用雙波長法測定基因沉默植株和對照植株籽粒中淀粉含量[15]。另選取60粒種子，每10粒為一組，對籽粒的長度和寬度進行測定。通過計算3組百粒重來評價籽粒的千粒重。以上所有數(shù)據(jù)均進行3次生物學(xué)重復(fù)，用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)顯著性。以BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP沉默小麥中的成熟籽粒為材料，橫向切割后，用導(dǎo)電膠帶固定，離子濺射儀(HITACHIE-1010，日本)噴金后，在掃描電鏡(HITACHI S-3400N-Ⅱ,日本)下拍照，觀察小麥胚乳淀粉粒形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaERFL1a基因沉默植株的獲得

將BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP病毒分別接種在即將開花的小麥穗部。接種23 d后，穗部和穗下節(jié)均出現(xiàn)大麥條紋花葉病病毒表型(圖2A)，表明病毒已成功感染麥穗。用qPCR檢測了接種后23 d穗部有病毒表型的籽粒中TaERFL1a基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a植株的籽粒，TaERFL1a的表達(dá)量顯著低于對照植株，降幅為 67.3%～ 93.4%(圖2B和C)，表明接種BSMV-VIGS-TaERFL1a病毒的籽粒內(nèi)TaERFL1a基因的表達(dá)被顯著抑制，獲得TaERFL1a基因沉默的小麥植株。

2A中1、2和3分別表示未接種小麥穗、接種BSMV-VIGS-GFP和接種BSMV-VIGS- TaERFL1a的小麥穗部；2B和2C分別表示用Actin和GAPDH為內(nèi)參基因?qū)?TaERFL1a轉(zhuǎn)錄水平的計算結(jié)果。*表示接種BSMV-VIGS-GFP與接種BSMV-VIGS- TaERFL1a的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.2 TaERFL1a在小麥籽粒淀粉合成中的功能

與接種BSMV-VIGS-GFP植株相比，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a的小麥植株的穗部表型沒有顯著的變化，但TaERFL1a基因沉默植株成熟籽粒偏小，充實度低，籽粒干癟(圖3)。定量測定結(jié)果表明，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a的小麥成熟籽粒的粒長、粒寬、千粒重和淀粉含量均顯著降低，分別降低了5.22%、12.70%、9.53%和5.43%(表1)。

表1 接種BSMV-VIGS-GFP和BSMV-VIGS- TaERFL1a小麥植株的成熟籽粒和淀粉性狀

dpi：病毒接種小麥穗部后的天數(shù)。

電鏡掃描結(jié)果顯示，TaERFL1a基因沉默植株籽粒和對照小麥籽粒胚乳中淀粉粒存在較大差異。TaERFL1a基因沉默植株籽粒中胚乳大顆粒的A型淀粉數(shù)目與對照無明顯差異，淀粉粒排列松散，但小顆粒的B型淀粉數(shù)目顯著減少(圖4)，表明TaERFL1a可能通過影響B(tài)型淀粉粒的形成而影響淀粉的合成。

圖4 接種病毒植株成熟籽粒胚乳掃描電鏡的觀察結(jié)果

3 討 論

黃淮地區(qū)是我國冬小麥的主產(chǎn)區(qū)，該區(qū)冬小麥分蘗基本能夠滿足成穗數(shù)需求，且多花多粒的優(yōu)勢明顯，有利于形成大穗多粒，但由于該區(qū)小麥灌漿期常出現(xiàn)不利天氣，導(dǎo)致灌漿期較短(35 d左右)，使許多小麥品種高粒重潛力難以得到充分發(fā)揮，因而制約了產(chǎn)量的進一步提高[16]。目前，黃淮地區(qū)大面積推廣的小麥品種的千粒重潛力大多在48 g以上，但在實際生產(chǎn)中，這些品種的千粒重常年在42 g以下，飽滿度較差，因此，僅粒重這一個指標(biāo)，這些品種增產(chǎn)潛力可達(dá)900 kg·hm-2以上(以千粒重增加1 g，每公頃增加150 kg計算)。淀粉是小麥籽粒最重要的組分，因此，提高粒重主要在于提高籽粒淀粉的合成能力。

轉(zhuǎn)錄因子是生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要成員，它能與一個或數(shù)個功能基因的啟動子相結(jié)合，從而調(diào)控下游一系列基因的表達(dá)，比調(diào)控單一功能基因能獲得更好的效果，因此成為近年來研究的熱點[17]。作物籽粒淀粉相關(guān)研究主要集中在功能基因方面，而對調(diào)控功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子報道較少，且集中在水稻和玉米方面[17]。本研究結(jié)果顯示，抑制TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)后，小麥籽粒的粒長、粒寬和千粒重均顯著降低，表明TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子影響小麥籽粒的粒重。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TaERFL1a基因沉默植株籽粒淀粉含量顯著降低，表明抑制該基因的表達(dá)能顯著影響淀粉的合成；電鏡觀察結(jié)果顯示，TaERFL1a可能通過影響籽粒中B型淀粉粒的形成參與了淀粉的合成，進而影響了粒重。已有研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsbZIP58轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合SBE1的啟動子，通過調(diào)控SBE1表達(dá)參與淀粉的合成[7]；玉米中ZmbZIP91轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合AGPS1、SSI、SSIIIa和ISA1基因上游啟動子特異元件，調(diào)控其表達(dá)，影響玉米淀粉的合成[9]；小麥中ERF轉(zhuǎn)錄因子通過特異結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的GCC-box或DRE/CRT元件來調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[18]。因此，推測本研究中小麥TaERFL1a轉(zhuǎn)錄因子可能與淀粉合成相關(guān)基因啟動子序列上的特異性順式作用元件相結(jié)合，從而調(diào)控了它們的表達(dá)，參與了小麥籽粒淀粉合成。