2 種木霉菌對寒地水稻立枯病病原菌的拮抗作用研究

戰(zhàn)鑫 臺蓮梅* 劉銅 張有利 鄭雯 靳亞忠

（1黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶163319；2 海南大學植物保護學院，海口570228；第一作者：1323834999@qq.com；*通訊作者：tailianmei@sina.com；liutongamy@sina.com）

黑龍江省寒地水稻種植面積大約為332.5 萬hm2，占全國水稻種植面積的11.0%，是我國水稻種植面積最大的省[1]。水稻立枯病是水稻育苗階段最常見的一種病害，嚴重發(fā)生時會引起秧苗成片爛秧和枯死。有研究報道，水稻立枯病由多種病原菌復合侵染所引起，不同地區(qū)的病原菌優(yōu)勢種有所不同，黑龍江地區(qū)主要優(yōu)勢病原菌為禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、茄腐鐮孢菌Fusarium solani、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[2]。在生產上，目前黑龍江主要采用惡霉靈防治水稻立枯病[3]。有報道申嗪霉素、咪鮮胺、惡霉靈等藥劑混配室內對病菌有一定的抑制作用，但生產中未應用[4-5]。由于長期應用單一的殺菌劑防治立枯病，易使病原菌產生抗藥性，降低防效，并造成環(huán)境污染。因此，尋找和研發(fā)生防制劑防治水稻立枯病，對水稻綠色優(yōu)質生產具有重要意義。

木霉菌是廣泛存在于土壤中，具有拮抗植物病原物的重要生防微生物，在植物病害生物防治過程中具有重要的、不可忽視的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對植物病原菌具有廣譜性的拮抗作用，目前發(fā)現(xiàn)至少對18個屬29 種病原真菌有拮抗作用[6]。木霉菌可以防治多種由鐮孢菌、絲核菌引起的病害，如甜瓜根腐病、玉米紋枯病。但是，木霉菌對水稻立枯病拮抗作用的研究報道很少。本文擬通過對峙培養(yǎng)、代謝物質對引起寒地水稻立枯病的4 種病原菌抑制作用及幾丁質酶的活性的檢測，研究2 種木霉菌對引起水稻立枯病的4 種病原菌的拮抗效果，為進一步開發(fā)復合木霉菌制劑防治水稻立枯病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試原菌：禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium、茄腐鐮孢菌Fusarium solani以及立枯絲核菌Rhizoctonia solani。

供試木霉菌菌株：哈茨木霉（Trichoderma.harziamun）和短密木霉（Trichoderma.breve）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基、PD 培養(yǎng)液。

木霉菌幾丁質酶產酶培養(yǎng)基：稱取粉末狀幾丁質0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.2 g，NH4NO30.3 g，蒸餾水定容至100 mL。

DNS 溶液：37.4 g 酒石酸鉀鈉溶于少量蒸餾水中，加熱至75℃，依次加入3,5 二硝基水楊酸1.26 g、NaOH 4.2 g、無水硫酸鈉1.0 g，攪拌至溶解。冷卻后用蒸餾水定容至200 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 對峙培養(yǎng)

將哈茨木霉和短密木霉和4 種病原菌從保存試管斜面中轉接于PDA 培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)5 d。用打孔器（φ=5 mm）將木霉菌和病原菌打成菌餅，分別對稱接種到平板PDA 培養(yǎng)基兩側，中間相距6 cm。培養(yǎng)7 d 后測量病原菌菌落指向木霉的半徑，空白對照測量病原菌指向圓心的半徑，計算抑制率，并觀察拮抗效果，每個處理5 次重復。

2.4 兩組患者治療前后PV及IPSS評分比較 常規(guī)治療組患者治療前后IPSS評分、PV差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評分較治療前明顯改善，PV明顯縮小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評分及PV較常規(guī)治療組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 2 種木霉菌對4 種病原菌生長抑制及拮抗作用

圖1 2 種木霉菌對4 種病原菌生長的拮抗

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

拮抗效果分級標準：Ⅰ，木霉菌絲占據(jù)平皿100%；Ⅱ，木霉菌絲占據(jù)平皿＞2/3；Ⅲ，木霉菌絲占據(jù)平皿＞1/3但＜2/3；Ⅳ，木霉菌絲占據(jù)平皿＜1/3；Ⅴ，病原菌（指示菌）占據(jù)平皿100%。

1.2.2 發(fā)酵液對病原菌的抑制作用

將活化的木霉轉接于PD 培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)，轉速為150 r/min，在25℃下培養(yǎng)7 d 后，收集發(fā)酵液，然后用0.22 μm 無菌濾膜過濾，將10 mL 過濾液與加熱的40 mL PDA 培養(yǎng)基混合均勻后倒平板，分別轉接4 種不同的病原菌，對照為10 mL PD 培養(yǎng)基與40 mL PDA 培養(yǎng)基均勻混合倒平板。在28℃下培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計算發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用，試驗重復3 次。

1.2.3 揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用

揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用采用對扣培養(yǎng)法[8]，木霉菌菌餅（φ=5 mm）接種于PDA 平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，在平板上方鋪蓋1 張直徑為9 cm 的單層無菌玻璃紙，然后對扣1 個大小相等且接有直徑5 mm 的病原菌菌餅的平板，封口膜密封后，28℃恒溫培養(yǎng)。以只接種病原菌的平板對扣處理作為對照，每處理重復3 次，3 d 后計算抑制率。

1.2.4 非揮發(fā)物質對病原菌的抑制作用

1.2.5 幾丁質酶活性檢測

首先制備膠態(tài)幾丁質，其制備方法參照Berger[9]。幾丁質酶活性測定具體操作方法：將發(fā)酵2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 的發(fā)酵液經(jīng)三層紗布過濾，然后取5 mL 濾液加入2.0 mL 膠態(tài)幾丁質，于37℃保溫3 h，然后取2.0 mL 濾液加入1.5 mL DNS、1.0 mL 緩沖液，沸水浴10 min，冷水冷卻至室溫，540 nm 比色測定OD 值。以100℃滅活10 min 的酶液為空白對照，3 次重復。以1 mL 粗酶液每小時分解膠態(tài)幾丁質產生l μmol 還原糖（葡萄糖）的酶量定義為1 個酶單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2019 和SPSS 20.0 對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 對4 種病原菌的抑制和拮抗作用

通過對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉和短密木霉對4 種病原菌的生長抑制作用有明顯差異（表1）。哈茨木霉對尖孢鐮孢菌的抑制率最大，為79.04%；短密木霉對禾谷鐮孢菌的抑制率最大，為88.6%。然而2 種木霉對立枯絲核菌的抑制率均最小，分別45.63%和48.59%。通過拮抗觀察，2 種木霉對尖孢鐮孢菌和茄腐鐮孢菌拮抗效果相似，但是短密木霉對禾谷鐮孢菌和立枯絲核菌比哈茨木霉拮抗效果更強。

表2 2 種木霉菌發(fā)酵液對4 種病原菌的抑制作用

表3 2 種木霉揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用

表4 木霉非揮發(fā)物質對病原菌的抑制作用

表5 2 種木霉菌幾丁質酶活性測定 （U/mL）

2.2 發(fā)酵液對病原菌的抑制作用

由表2 可以看出，2 種木霉菌代謝液對4 種病原菌均有抑制作用，但是對不同的病原菌的抑制作用有顯著差異。哈茨木霉發(fā)酵液對尖孢鐮孢菌抑制率較高，為58.24%，與其他病原菌的處理差異顯著；對茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較低，分別為36.74%和43.30%。短密木霉發(fā)酵代謝液對茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較高，對尖孢鐮孢菌和立枯絲核菌的抑制率較低。

2.3 揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用

采用對扣培養(yǎng)法測定了2 種木霉揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用。從表3 可見，哈茨木霉和短密木霉均能產生揮發(fā)性物質抑制4 種病原菌的生長，但抑制作用不強，短密木霉對茄腐抑制率最高，但是僅為35.29%，對禾谷鐮孢菌抑制效果最差，僅為6.17%。兩種木霉菌對4 種病原菌的抑制效果有顯著差異。

2.4 非揮發(fā)性物質對病原菌的抑制作用

利用圓盤濾膜法測定了哈茨木霉與短密木霉的難揮發(fā)物質對4 種病原菌的抑制作用。從表4 可見，2 種木霉菌產生的非揮發(fā)性物質對4 種病原菌的抑制作用較強，抑制率均在55.00%以上。其中，對禾谷鐮孢菌的抑制效果最好，抑制率分別為66.78%和70.12%，與其他病原菌處理差異顯著。與揮發(fā)性物質相比，難揮發(fā)性物質對病原菌有更強的抑制效果。

2.5 幾丁質酶活性檢測

2 種木霉菌株分別在培養(yǎng)第3、4、5、6、7 d 后進行幾丁質酶活性檢測，結果發(fā)現(xiàn)，2 種木霉菌均能產生幾丁質酶，隨著培養(yǎng)時間增加酶的活性逐漸升高，第4 d達到最大值，隨后酶的活性逐漸降低。哈茨木霉的幾丁質酶的活性最高為1.46 U/mL、短密木霉的幾丁質酶活性最高為1.00 U/mL。哈茨木霉產生的幾丁質酶活性顯著高于短密木霉產生的酶活性（表5）。

3 結論與討論

水稻立枯病的防治主要采用化學防治方法，其防治效果不明顯，并對環(huán)境有較大的污染。運用木霉菌進行綠色防治，發(fā)展綠色農業(yè)十分有意義。選擇拮抗效果好的木霉菌是研制木霉菌制劑的前提。李和平等[10]只通過對峙試驗的方法來篩選木霉菌，篩選方式過于單一。本研究系統(tǒng)的通過競爭作用、抗生作用、溶菌作用等方法研究，能更好地了解哈茨木霉與短密木霉對黑龍江地區(qū)水稻立枯病菌的拮抗作用。

研究結果顯示，2 種木霉菌具有較強的營養(yǎng)和空間競爭能力；2 種木霉的非揮發(fā)性物質比揮發(fā)性物質具有更強的抑制效果，表明木霉的抑菌物質主要來源于非揮發(fā)性物質，這與前人報道相一致[8]。木霉菌可以產生大量化學性質各不相同的抗菌物質, 包括戊酮、辛酮、類菇、多膚和氨基酸衍生物等幾大類，其中僅抗真菌的代謝產物便超過70 種，并且多數(shù)木霉產生的抗生物質不止一種[11-14]。如哈茨木霉可產生12 種，康氏木霉菌可產生9 種，綠色木霉可產生10 種，鉤狀木霉可產生7 種，長枝木霉可產生3 種，多孢木霉可產生2 種?？梢?，不同種木霉菌的抗生能力不同。因此，在使用木霉菌進行生物防治時應多種木霉菌復配以提高防治效果。本研究結果表明，哈茨木霉的幾丁質酶活性高于短密木霉，但是短密木霉卻有更好的營養(yǎng)競爭能力和抗生作用。說明2 種木霉菌對供試的4 種病原菌抑制效果不完全一致，與前人報道相符合[15]。通過室內研究后，下一步將哈茨木霉與短密木霉進行復配應用于田間，驗證2 種木霉菌對水稻立枯病的防效。本研究結果可為下一步研發(fā)木霉菌制劑防治寒地水稻立枯病提供依據(jù)，但對木霉菌的協(xié)同抗性有待深入研究。