4 種蕨類植物中多糖、總黃酮、綠原酸含量的測定及比較研究

樊竹青，楊文麗，謝 勇，李 麗

普洱學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000

蕨類植物現(xiàn)存約12 000 種，我國有61 科，223屬，約2 600 種，其中可供藥用的約300 余種，主要分布在華南及西南地區(qū)。云南是中國蕨類植物資源最豐富的地區(qū)之一，約有1 500 種，特有種類達(dá)200余種[1]，其西南部的熱帶雨林中，廣泛分布著多種具有藥用價值的蕨類植物，尚待研究和開發(fā)。

長葉實蕨為實蕨科（Bolbitidaceae）植物，根莖扁平長條狀，葉片形狀多樣。有清熱解毒、斂肺止咳、止血的功效，可治療咳嗽、吐血、痢疾、燒燙傷、跌打損傷、蛇咬傷、出血癥。

蕨類植物所表現(xiàn)出的功效與其所含的生物活性物質(zhì)是密不可分的，在蕨類植物的研究中，有關(guān)云南西南部蕨類活性成分的報導(dǎo)不多，對綠原酸的研究還是空白。選擇西雙版納熱帶雨林中長葉實蕨、卷柏、劍葉鳳尾蕨、半邊旗為實驗材料，測定其多糖、總黃酮及綠原酸含量，為藥用蕨類植物的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

采自云南省西雙版納州勐臘縣勐倫熱帶雨林中。將采集好的長葉實蕨、半邊旗、鳳尾蕨、卷柏迅速洗凈、烘干、研碎后用袋子密封備用。

1.2 主要設(shè)備

島津UV-2550 型紫外可見分光光度計、JW-100S 型超聲波清洗機、G80F23N1P-M8（S0）型微波爐。

1.3 多糖含量的測定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份），按1∶30 加蒸餾水，充分浸泡，放入到微波爐中，中火處理，計時15min；然后將樣品放于80℃水浴中提取1h，定時攪拌；完成后離心，獲取上清液；放在60℃水浴中進(jìn)行濃縮，體積減至20～25mL 時即可。向濃縮液中加入無水乙醇，二者體積比為3：1，得到的混合液后進(jìn)行離心，棄上清液，留取沉淀物；沉淀物中加入3%三氯乙酸脫蛋白，放入冷凍干燥箱進(jìn)行冷凍干燥，所獲得產(chǎn)物即為多糖粗品。加入蒸餾水，使其充分溶解，再次定容至50mL，備用。

采用苯酚-硫酸法來測多糖含量。以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品（蒸餾水為溶劑），試劑空白作為參比，在最大吸收波長490nm 處測定吸光度值。以吸光度值作為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多糖含量。

1.4 總黃酮含量測定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份）放入錐形瓶中，加入30 倍體積60%乙醇溶液，用超聲提取法，超聲設(shè)置功率為75W，溫度60℃、30min 進(jìn)行提取，對提取液進(jìn)行抽濾，獲得濾液，備用。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品來配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（60%乙醇為溶劑），試劑空白作為參比，在最大吸收波長520nm 處測定吸光度值。以吸光度值作為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總黃酮含量。

1.5 綠原酸含量測定

分別稱取4 種蕨類植物干粉各兩份（1.0000g/份）放入錐形瓶中，加入15 倍體積95%乙醇，利用超聲提取法，超聲設(shè)置功率為60W，溫度50 ℃、40min 進(jìn)行提取，提取液進(jìn)行抽濾，濾液備用。

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液（95%乙醇為溶劑）試劑空白作為參比，在最大吸收波長330nm 處測定吸光度值，以吸光度值作為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 研究結(jié)果

2.1 多糖含量測定結(jié)果

用紫外可見分光光度計于490nm 處測定各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸方程y=0.0064x+0.0048，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明葡萄糖在0-100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 多糖含量測定結(jié)果

4 種蕨類植物多糖含量由高到低順序依次為半邊旗＞劍葉鳳尾蕨＞卷柏＞長葉實蕨，含量最高的半邊旗或比含量最低的長葉實蕨高出了1.5072%，這個差值甚至高于卷柏的含量。較高的兩個種均屬于鳳尾蕨屬。

2.2 黃酮含量測定結(jié)果

用紫外可見分光光度計于520nm 處測定各蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸曲線方程y=0.0124x-0.0104，相關(guān)系數(shù)=0.9991，表明蘆丁在0～48μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 總黃酮含量測定結(jié)果

黃酮類化合物是藥用植物研究中關(guān)注度很高的活性成分。4 種蕨黃酮含量的差異不如多糖明顯，含量由高到低依次為長葉實蕨＞卷柏＞半邊旗＞劍葉鳳尾蕨，與多糖含量的排序幾乎相反，長葉實蕨的多糖含量最低但黃酮含量卻最高，多糖含量占優(yōu)勢的半邊旗和葉鳳尾蕨的黃酮含量卻較低。

2.3 綠原酸含量的測定結(jié)果

用紫外分光光度計于330nm 處測定各綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（A），然后以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，回歸曲線方程y=0.0520x-0.0026，相關(guān)系數(shù)=0.9993，表明綠原酸在0～16μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 綠原酸含量測定結(jié)果

綠原酸有多種生物活性，通常認(rèn)為是植物體內(nèi)最重要的抗菌、抗病毒成分。4 種蕨的綠原酸含量依次為半邊旗＞卷柏＞長葉實蕨＞劍葉鳳尾蕨，其中半邊旗和卷柏的綠原酸含量略占優(yōu)勢，但總體差異不大。

把4 種蕨類植物的多糖、總黃酮及綠原酸含量進(jìn)行比較（見圖1），看它們在不同植物種內(nèi)的變化趨勢。

從圖中可以看出，多糖含量相對較高且不同種間的差異明顯，半邊旗的多糖顯著高于其它3 個種；總黃酮和綠原酸的含量在4 種蕨類植物中則比較接近，種間差異很小。

3 討論

許柑葉對福州市高蓋山公園的8 種蕨包括芒萁、烏蕨、蕨、蜈蚣蕨、井欄邊蕨、金粉蕨、扇葉鐵線蕨、華南毛蕨的多糖做過測定，含量依次為5.49%、0.64%、1.73%、3.83%、1.22%、3.46%、4.76%、1.21%[4]；林勤等對福建漳州芝山公園半邊旗多糖的測定結(jié)果為2.18%[5]，實驗中4 種蕨的多糖含量在1.2039%～2.7111%之間。在以上共涉及12個種的結(jié)果中，不同種蕨類植物的多糖含量差異較明顯，含量最高的芒萁可以達(dá)到5.49%，最低的烏蕨僅為0.64%，半邊旗和劍葉鳳尾蕨的含量處于中間位置。

在總黃酮的含量上，蘇云山對采自紅河、昭通、文山等地的15 個屬共32 個種的蕨類植物做過測定，結(jié)果狗脊蕨屬的狗脊蕨和單芽狗脊的分別達(dá)到了8.70%和8.38%，是32 個種中含量最高的[1]，其余多數(shù)種在1%～5%之間，但云南鳳尾蕨僅為0.50%；梁曉華對采自哀牢山國家自然保護(hù)區(qū)的13 種蕨類植物總黃酮含量也做過測定，大多數(shù)蕨的總黃酮含量在1%～4%之間，但大葉假冷蕨葉片的總黃酮含量達(dá)到了令人驚訝的10.375%[6]，而筆管草卻僅為0.1%；傅玉萍對廣東湛江寸金產(chǎn)的半邊旗的總黃酮含量為0.78%[7]。實驗中所測的4 種蕨總黃酮含量在0.2342%～0.3837%之間，處于中下水平。總體來看，總黃酮的含量也與多糖類似，也有較明顯的種屬差異性。

分析不同文獻(xiàn)對多糖和黃酮的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)明顯差異的原因，除了種的因素外，采集地點、采集時間、植物的發(fā)育狀態(tài)、提取部位、提取及測定的方法和步驟等均可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，需要重視這些影響因素帶來的數(shù)據(jù)變化。

綠原酸是藥用植物中另一種重要的生物活性物質(zhì)，但它的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在提取過程中易發(fā)生異構(gòu)化，受熱、見光易氧化，這給綠原酸的測定增大了難度。有關(guān)蕨類植物的綠原酸含量的報導(dǎo)很少，從測定的結(jié)果來看，4 種蕨的含量在0.1113%～0.1519%之間，與其它藥用植物金銀花、山銀花相比，并沒有優(yōu)勢，但鑒于蕨類植物綠原酸含量方面的資料太少，還有必要展開進(jìn)一步研究。

實驗室在前期用4 種蕨的水提取液進(jìn)行了抑菌實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉作為指示菌時，4 種蕨類植物的水提取物可抑制除黑曲霉以外其余4 種微生物的生長，并以半邊旗對大腸桿菌的抑制作用最為明顯，并表現(xiàn)出提取液濃度與抑菌性的正相關(guān)關(guān)系，但這種抑菌活性是否與上述3 種活性成分呈正相關(guān)關(guān)系，是后期將要繼續(xù)的工作。

4 結(jié)語

多種蕨類植物被載入《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》等藥典，蕨類植物在民藥中也應(yīng)用廣泛，但相關(guān)研究成果卻不多。應(yīng)用現(xiàn)代科研手段，對有藥用價值的蕨類進(jìn)行系統(tǒng)研究，不僅是對中藥材開發(fā)利用的發(fā)揚光大，更重要的是把大自然饋贈給人類的資源寶庫進(jìn)行濃度挖掘，更好造福于人類。