基于相關(guān)性的麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜研究

王迎春 麻景梅 王夢(mèng) 曹文利 李軍山 牛麗穎

摘 要：為更好地評(píng)價(jià)麻黃配方顆粒、飲片和水煎劑的一致性，分別建立麻黃配方顆粒、飲片和水煎劑的HPLC特征圖譜，使用Wondasil C?18?（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，分別得到10批麻黃配方顆粒、飲片和水煎劑的特征圖譜，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明，麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜中的13個(gè)共有峰均能在水煎劑中得到追蹤，11個(gè)共有峰可在飲片中得到追蹤。經(jīng)方法學(xué)考察認(rèn)為，所建立的麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜方法穩(wěn)定，具有較高的重復(fù)性、穩(wěn)定性及可信度，可用于麻黃配方顆粒、飲片和水煎劑的一致性評(píng)價(jià)，也可為麻黃配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);特征圖譜;麻黃配方顆粒;麻黃飲片;麻黃水煎劑;相關(guān)性

中圖分類號(hào)：R917?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi： 10.7535/hbgykj.2020yx04012

文章編號(hào)：1008-1534（2020）04-0286-05

Abstract：In order to better evaluate the consistency of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction， the HPLC characteristic chromatograms of them were established respectively. The analysis was performed on Wondasil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase for gradient?elution?. The column temperature was maintained at 30 ℃， the flow rate was set at 1.0 mL/min and the detection wavelength was 210 nm. The HPLC characteristic chromatograms of 10 batches of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction obtained were established and their correlation analysis was carried out. The results show that 13 common peaks in the HPLC characteristic chromatograms of Ephedra formula granules can be tracked in the aqueous decoction， and 11 common peaks can be tracked in the decoction pieces. The methodology study proves that the method for the HPLC characteristic chromatograms of Ephedra formula granules is stable， with high repeatability， stability and credibility. It can be used for the consistency evaluation of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction， which also provide reference for the quality control of Ephedra formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese materia medica; characteristic chromatograms; Ephedra formula granules; Ephedra decoction pieces; Ephedra aqueous decoction; correlation

麻黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf、中麻黃Ephedra intermediate Schrenk et C.A.Mey.或木賊麻黃Ephedra equisetina Bge.的干燥草質(zhì)莖[1]，是中國(guó)臨床常用的中草藥?，F(xiàn)代研究表明，麻黃中含生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酚酸、糖類及鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分，其中生物堿是麻黃的有效成分，具有平喘、利尿、鎮(zhèn)痛、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2-4]。

傳統(tǒng)中藥煎煮耗時(shí)、攜帶不便的缺點(diǎn)與人們快速的生活節(jié)奏之間的矛盾日漸突出，中藥配方顆粒的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥飲片的不足。中藥配方顆粒是參照傳統(tǒng)中藥煎煮方式，以單味飲片為原料，采用水煎提取后，經(jīng)過(guò)一系列現(xiàn)代加工工藝制備而成的，具有免煎易服、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。中藥配方顆粒的藥效物質(zhì)應(yīng)與中藥飲片水煎劑保持基本一致，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)麻黃配方顆粒、麻黃飲片、水煎劑三者特征圖譜的研究，從化學(xué)成分上對(duì)比分析三者的差異，從而為麻黃配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供參考。

1?主要儀器與材料

1.1?儀器

高效液相色譜儀：Ultimate 3000，DAD檢測(cè)器，變色龍色譜工作站，美國(guó)賽默飛公司提供;色譜柱：Wondasil C?18?（4.6 mm×250 mm，5 μm），日本島津公司提供;電子天平：TB-215D（十萬(wàn)分之一）、BSA224S-CW（萬(wàn)分之一），德國(guó)賽多利斯公司提供;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠提供;冷凍干燥機(jī)：FILOT5-8L，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司提供。

1.2?試劑

鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)：0714-201007）、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)：171237-201208），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇（色譜級(jí)）和乙腈（色譜級(jí)），F(xiàn)isher化學(xué)試劑公司提供;磷酸（分析級(jí)），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供;水為超純水。

1.3?飲片、配方顆粒

10批麻黃飲片（編號(hào)為Y1—Y10）分別來(lái)自內(nèi)蒙古（3批）、遼寧（2批）、河北（3批）、山西（2批），經(jīng)神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司（以下簡(jiǎn)稱神威藥業(yè)）質(zhì)量檢測(cè)中心鑒定為草麻黃（Ephedra sinica Stapf）的干燥草質(zhì)莖。

10批麻黃配方顆粒（編號(hào)為K01—K10）中K01—K06為中試小樣，K07—K10為中試成品，批號(hào)分別為18062931，18071331，18082831，18041731，神威藥業(yè)提供。

2?實(shí)驗(yàn)部分

以麻黃配方顆粒、飲片、水煎劑為研究對(duì)象，參考文獻(xiàn)[8—15]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。

2.1?麻黃水煎劑的制備

取麻黃飲片100 g，煎煮2次，一煎加水1 000 mL，浸泡30 min，保持微沸20 min，趁熱過(guò)濾;二煎加水800 mL，保持微沸15 min，趁熱過(guò)濾，將2次藥液混合，減壓濃縮（溫度50 ℃）至約200 mL的浸膏，冷凍干燥得干膏粉。

2.2?對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解定容，制成每1 mL含鹽酸麻黃堿43.36 μg和鹽酸偽麻黃堿21.67 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3?供試品溶液的制備

2.3.1麻黃配方顆粒供試品溶液的制備

取研細(xì)的麻黃配方顆粒約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇50 mL，并滴加1滴磷酸，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min后取出（功率250 W，頻率35 kHz），放至室溫，再次稱定質(zhì)量，減失的質(zhì)量用70%的甲醇補(bǔ)足，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3.2?麻黃水煎劑供試品溶液的制備

按“2.1”項(xiàng)下麻黃水煎劑的制備方法制備干膏粉，取干膏粉約0.1 g，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.3?麻黃飲片供試品溶液的制備

取適量麻黃飲片，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4?色譜條件

色譜柱為Wondasil C?18?柱（4.6 mm×250 mm，?5 μm?）;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。洗脫條件見(jiàn)表1。

2.5?方法學(xué)考察

依據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下的供試品制備方法制備麻黃配方顆粒（批號(hào)：18062931）供試品溶液（以下簡(jiǎn)稱麻黃配方顆粒供試品溶液），按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)。

2.5.1?精密度試驗(yàn)

對(duì)同一份麻黃配方顆粒供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，將主要特征峰的保留時(shí)間和峰面積分別與鹽酸麻黃堿峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行對(duì)比，所得各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.09%～0.27%，相對(duì)峰面積RSD為0.66%～2.83%，表明儀器精密度良好。

2.5.2?重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份麻黃配方顆粒供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，將主要特征峰的保留時(shí)間和峰面積分別與鹽酸麻黃堿峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行對(duì)比，所得各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.04%～0.30%，相對(duì)峰面積RSD為1.34%～2.87%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份麻黃配方顆粒供試品溶液分別于0，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，將主要特征峰的保留時(shí)間和峰面積分別與鹽酸麻黃堿峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行對(duì)比，所得各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～0.31%，相對(duì)峰面積的RSD為0.74%～2.77%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6?特征圖譜的建立及相關(guān)性分析

2.6.1?特征圖譜的建立

按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件，分別將10批麻黃配方顆粒供試品溶液注入高效液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定，將10批麻黃配方顆粒特征色譜圖以AIA格式導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012）”軟件，進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜（見(jiàn)圖1），10批麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜（見(jiàn)圖2），其相似度見(jiàn)表2。由圖表可知，10批麻黃配方顆粒特征圖譜的相似度均在0.96以上，10批麻黃配方顆粒有13個(gè)共有峰，經(jīng)與混合對(duì)照品色譜圖對(duì)比，指認(rèn)4號(hào)峰為鹽酸麻黃堿，5號(hào)峰為鹽酸偽麻黃堿。鹽酸麻黃堿是麻黃的主要成分之一，該色譜峰分離度較好，響應(yīng)強(qiáng)度大，因此選擇鹽酸麻黃堿為參照峰。

采用相同方法分別建立麻黃飲片和水煎劑的HPLC特征圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，色譜圖見(jiàn)圖3和圖4，相似度見(jiàn)表2。由結(jié)果可知，10批麻黃飲片特征圖譜的相似度均在0.87以上;10批麻黃水煎劑特征圖譜的相似度均在0.95以上。

2.6.2?特征圖譜的比較

比較麻黃飲片、水煎劑、配方顆粒對(duì)照特征圖譜（見(jiàn)圖5），三者有11個(gè)共有峰，采用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算三者的相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，三者相似度均在0.90以上。麻黃配方顆粒13個(gè)特征峰在水煎劑中均能得到追蹤，說(shuō)明麻黃配方顆粒和水煎劑的化學(xué)成分基本一致。麻黃飲片因用甲醇提取，所含成分較水煎劑和配方顆粒多，色譜峰的分離度較配方顆粒和水煎劑小，峰型較差，但主要特征峰的數(shù)目與配方顆粒和水煎劑基本一致。

3?討?論

麻黃水煎劑的煎煮方法參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》進(jìn)行，分別考察了加水量為8倍、10倍和12倍水時(shí)的出膏率，以及干膏粉中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，最終確定加水量為一煎加10倍水，二煎加8倍水。

由于麻黃配方顆粒是麻黃飲片水提后經(jīng)一系列工藝加工而成，因此選擇甲醇作為提取溶劑、超聲提取，來(lái)制備麻黃配方顆粒的供試品溶液。試驗(yàn)中考察了不同濃度的甲醇（50%，70%，100%）對(duì)提取效果的影響。用100%甲醇提取的麻黃配方顆粒供試品溶液色譜峰峰型及分離度較差，且鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量較低;50%甲醇提取的供試品溶液基線略飄，70%甲醇的提取效果最好。

試驗(yàn)中還考察了超聲提取時(shí)間（20，30，40 min）對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間為20，30，40 min的提取效果差別不大，故選擇超聲提取時(shí)間為20 min。

本試驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，分別在210，230，240，254 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)比較基線平穩(wěn)程度、色譜圖信息量、出峰時(shí)間等，最終選定檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

流動(dòng)相分別考察了甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸，對(duì)比兩者梯度洗脫效果，乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相的色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離效果更優(yōu)。

4?結(jié)?語(yǔ)

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD建立的麻黃配方顆粒特征圖譜方法穩(wěn)定、重復(fù)性好。麻黃配方顆粒HPLC特征圖譜中的13個(gè)共有峰，其中11個(gè)共有峰可在飲片中得到追蹤，13個(gè)共有峰均可在水煎劑中得到追蹤。麻黃飲片特征圖譜中10號(hào)峰在配方顆粒和水煎劑中缺失，可能是麻黃飲片經(jīng)過(guò)高溫提取、濃縮等一系列加工后分解，轉(zhuǎn)化為其他成分。10批麻黃配方顆粒、水煎劑、飲片的特征圖譜基本一致，特別是麻黃配方顆粒和水煎劑特征圖譜的相似度在0.900以上，這表明麻黃配方顆粒中的主要化學(xué)成分與其水煎劑中的化學(xué)成分基本相同，可為麻黃配方顆粒的臨床應(yīng)用提供參考。

本研究只指認(rèn)了特征圖譜中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿2個(gè)特征峰，后續(xù)還需進(jìn)一步指認(rèn)其余特征峰，以獲得更多信息，從而更好地監(jiān)控麻黃配方顆粒的質(zhì)量。

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