改性蛭石吸附-包埋法固定化脂肪酶的研究

黃靜，梁密

1(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 理學(xué)院，遼寧 阜新，123000)2(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 材料學(xué)院，遼寧 阜新，123000)

脂肪酶又名三酰基甘油水解酶(EC 3.1.1.3)，在植物、動(dòng)物以及微生物中較普遍存在[1-2]。其廣泛應(yīng)用于造紙工業(yè)、有機(jī)合成工業(yè)、污劑工業(yè)、食品工業(yè)及生物表面活性劑工業(yè)中，尤其脂肪酶在進(jìn)行生物柴油的合成工業(yè)中一直備受關(guān)注，是目前研究的熱點(diǎn)催化劑之一[3-6]。而脂肪酶成本高且易失活是制約其應(yīng)用的主要障礙[7]，脂肪酶根據(jù)其應(yīng)用形式可分為游離酶與固定化酶。固定化酶是指通過(guò)物理或者化學(xué)的方法將酶結(jié)合在固定相載體上，使本來(lái)分散于流動(dòng)液相與底物均相混合的游離酶成為與底物異相接觸的固定相，從而使酶的催化反應(yīng)被限制在固定相上進(jìn)行[8]。游離酶在應(yīng)用中存在穩(wěn)定性較差、產(chǎn)物分離純化困難、不能反復(fù)利用等缺點(diǎn)[9-10]；而固定化酶對(duì)熱的穩(wěn)定性提高、對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)、具有較強(qiáng)的耐酸耐堿性、有較高抵制變性劑及抑制劑的性能、能夠?qū)崿F(xiàn)酶與產(chǎn)物的分離、可反復(fù)使用、降低成本，便于自動(dòng)化生產(chǎn)[11-13]。在脂肪酶的固定化方面，眾多學(xué)者對(duì)固定化載體及固定化方法開展了深入的研究[14-16]。楊本宏等[17]研究了海藻酸鈉作為載體，采用包埋的方法固定化德氏根霉脂肪酶的最佳條件。王愛(ài)玲等[18]以海藻酸鈉與明膠復(fù)合物為載體，用包埋法固定化黑曲霉脂肪酶，研究了海藻酸鈉、明膠濃度諸因素對(duì)固定化的影響，對(duì)固定化酶和游離酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

蛭石具有天然、豐富的孔徑結(jié)構(gòu)、比表面積較大、吸附性較好，機(jī)械剛性和熱穩(wěn)定性很好，能夠有效防止微生物的降解作用，環(huán)保且價(jià)格低廉，符合作為固定化酶載體的基本條件[19-20]；若對(duì)蛭石進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男?，還能提高其吸附能力等[21]。目前廣泛應(yīng)用的酶的固定化方法有交聯(lián)法、共價(jià)法、包埋法和吸附法。共價(jià)法和交聯(lián)法的反應(yīng)條件通常很劇烈，對(duì)酶造成的影響較大；包埋法和吸附法的反應(yīng)條件較溫和，對(duì)酶造成的影響較小。但是由于吸附法固定化脂肪酶的載體與酶的作用力很弱，容易脫落，其穩(wěn)定性較差，而包埋法是將酶限制在一定空間內(nèi)，可以提高其穩(wěn)定性。因此課題擬以改性蛭石為載體，采用吸附-包埋結(jié)合法對(duì)脂肪酶進(jìn)行固定化，探究脂肪酶的固定化機(jī)理及固定化脂肪酶的性能，為脂肪酶固定化載體、方法、機(jī)理的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉脂肪酶(20 000 U/g)、4-硝基苯磷酸二鈉鹽(disodium 4-nitrophenyl phosphate,p-NPP),Sigma公司;蛭石,石家莊雨馨建筑材料有限公司;HCl、NaH2PO4、Na2HPO4明膠、海藻酸鈉、CaCl2均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8恒溫水浴鍋，上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JSM-7800F掃描電子顯微鏡，日本島津制作所；THZ-82氣浴恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛭石的改性

1.3.1.1 蛭石的酸改性

分別將5 g 325目蛭石和1 000目蛭石與100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的HCl混合，80 ℃水浴下攪拌2 h，水洗至中性，60 ℃下烘干，備用。

1.3.1.2 改性蛭石的表征

分別取少量325目和1 000目改性前后蛭石噴金處理后，在JSM-7 800F掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.3.2 改性蛭石固定化脂肪酶條件的優(yōu)化

1.3.2.1 吸附法固定化脂肪酶條件的優(yōu)化

取1 g脂肪酶溶于30 mL H3PO4緩沖液中。將一定量干燥載體加入到脂肪酶緩沖溶液中，一定溫度下振蕩固定化一定時(shí)間后，過(guò)濾，用磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)洗滌至上清液中檢測(cè)不到脂肪酶。在單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇載體含量、固定化溫度及固定化時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。固定化酶按照游離酶的方法進(jìn)行酶活力測(cè)定，并根據(jù)公式(1)計(jì)算酶活力回收率：

(1)

1.3.2.2 吸附-包埋法固定化脂肪酶條件的優(yōu)化

在上述吸附好的酶反應(yīng)體系中加入15 mL一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉和15 mL一定質(zhì)量濃度的明膠，使其充分混合均勻，立刻將其用注射器注射到一定濃度的CaCl2中，形成最終的固定化酶。在單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇海藻酸鈉質(zhì)量濃度、明膠質(zhì)量濃度及CaCl2濃度3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。固定化酶按照游離酶的方法進(jìn)行酶活力測(cè)定，并根據(jù)公式(1)計(jì)算酶活力回收率。

1.3.3 脂肪酶活力測(cè)定

配制0～70 μmol/L濃度梯度的4-硝基苯酚溶液，測(cè)定OD405，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取4支試管(空白管及3支平行樣品管)，將150 μL適當(dāng)稀釋的酶液(游離酶或固定化酶)加入到2.70 mL Tris-HCl緩沖液中(50 mmol/L，pH 7.5)，其中空白管需要在沸水中煮5 min滅活酶，然后將4支試管置于恒溫振蕩器上(45 ℃，180 r/min)預(yù)熱5 min，再加入150 μL底物乳液(5 mmol/L p-NPP)，混勻后在恒溫振蕩器上反應(yīng)5 min(45 ℃，180 r/min)，隨即迅速置于沸水中煮5 min終止反應(yīng)，冷水浴降溫后測(cè)OD405[22]。

酶活力單位(U)定義：在以上條件下，1 min催化底物水解產(chǎn)生1 μmol 4-硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 固定化脂肪酶的表征

分別取少量最優(yōu)固定化條件下的吸附法固定化脂肪酶和吸附-包埋法固定化脂肪酶進(jìn)行噴金處理后，在JSM-7 800F掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.3.5 脂肪酶催化性能的研究

1.3.5.1 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性的研究

將一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境下4 h，取出測(cè)量其酶活力。

1.3.5.2 游離酶與固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的研究

取一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶放在4 ℃的冰箱里，每隔7 d取出測(cè)量1次酶活力。以殘留酶活為測(cè)定指標(biāo)，根據(jù)公式(2)計(jì)算殘留酶活：

(2)

1.3.5.3 游離酶與固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性的研究

固定化酶與游離酶反應(yīng)完成后，用pH=7的H3PO4緩沖液將其清洗至反應(yīng)物無(wú)殘留，進(jìn)行1、2、3、4、5次循環(huán)，每次分別對(duì)脂肪酶的活力進(jìn)行測(cè)定，以殘留酶活為測(cè)定指標(biāo)，根據(jù)公式(2)計(jì)算殘留酶活。

1.3.6 固定化脂肪酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

選取最佳固定化條件下的吸附-包埋法固定化脂肪酶，確定其濃度，將底物配置成不同濃度[S]的溶液，在40 ℃下反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)的初始速度[V]，用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，得到該固定化脂肪酶對(duì)底物的最大反應(yīng)速率Vmax和Km值等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的表征

圖1為325目和1 000目改性前后蛭石在2 000倍電鏡下的表面形態(tài)。由2 000倍電鏡圖可知，1 000目改性后蛭石出現(xiàn)了較多溝壑狀孔隙，比表面積較大，顆粒質(zhì)感疏松，較大的比表面積提供了與酶分子充分大的接觸面，使其更有利于吸附固定化脂肪酶。

a-325目改性前蛭石;b-325目改性后蛭石;c-1 000目改性前蛭石;d-1 000目改性后蛭石圖1 325目蛭石和1 000目蛭石改性前后的電鏡圖(×2 000)Fig.1 The SEM photograph of before and after modification of 325 mesh vermiculite and 1 000 mesh vermiculite

2.2 固定化脂肪酶的條件優(yōu)化

2.2.1 吸附法固定化脂肪酶的條件優(yōu)化

表1為正交試驗(yàn)結(jié)果，由表1可知，各因素對(duì)固定化酶回收率影響大小的先后次序?yàn)锽>C>A，即固定化時(shí)間>固定化溫度>載體含量；最佳提取條件為A1B2C2，即載體含量含量為1 g，固定化時(shí)間3 h，固定化溫度為25 ℃，在此條件下回收率可達(dá)到83.47%。這說(shuō)明，此最佳固定化工藝并沒(méi)有明顯降低酶的活性，酶的活性部位不受固定化載體的干擾。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

2.2.2 吸附-包埋法固定化脂肪酶的條件優(yōu)化

表2為正交試驗(yàn)結(jié)果，由表2可知，各因素對(duì)固定化酶回收率影響大小的先后次序?yàn)锽>C>A，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度>CaCl2濃度>明膠質(zhì)量濃度；最佳提取條件為A1B2C2，即明膠的質(zhì)量濃度為5 g/L，海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為20 g/L，CaCl2濃度0.04 mol/L，在此條件下回收率可達(dá)到82.77%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

2.3 固定化脂肪酶的表征

圖2為吸附法固定化脂肪酶和吸附-包埋法固定化脂肪酶在2 000倍電鏡下的表面形態(tài)。由2 000倍電鏡圖可知，脂肪酶吸附在改性蛭石上，吸附包埋法后形成了凝膠包埋的小球。

a-吸附法固定化脂肪酶;b-吸附-包埋法固定化脂肪酶圖2 固定化脂肪酶的電鏡圖(×2 000)Fig.2 The SEM photograph of Immobilized lipase

2.4 脂肪酶的催化性能

2.4.1 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性是衡量酶催化性能的一個(gè)重要指標(biāo)，它能使酶在高溫下發(fā)揮生物催化劑的作用，這可能是某些反應(yīng)過(guò)程所必需的[21]。由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度升高，游離與固定化脂肪酶的相對(duì)酶活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)相對(duì)酶活力最大；且固定化脂肪酶的相對(duì)酶活力較游離脂肪酶高，這說(shuō)明固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the lipase activity

2.4.2 游離酶與固定化酶的存儲(chǔ)穩(wěn)定性

酶的固定化是提高其存儲(chǔ)穩(wěn)定性的主要手段，固定化條件決定了酶的穩(wěn)定性，因?yàn)樗Q于酶與載體基質(zhì)之間的相互作用[21]。由圖4可知，存儲(chǔ)7 d后吸附-包埋法固定化脂肪酶的殘留酶活為98.38%，存儲(chǔ)21 d后為91.05%，存儲(chǔ)42 d后為66.71%，存儲(chǔ)56 d后為59.59%，這說(shuō)明固定化脂肪酶具有較高的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，這可能是由于固定化使脂肪酶的機(jī)械剛性增強(qiáng)，提高了其穩(wěn)定性。

圖4 固定化脂肪酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.4 The store stability on the immobilized lipase activity

2.4.3 游離酶與固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

酶的重復(fù)利用在生物催化過(guò)程中起著重要作用。由圖5可知，吸附-包埋固定化脂肪酶重復(fù)使用7次后，殘留酶活為85.33%。

圖5 固定化脂肪酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.5 The reustability on the immobilized lipase activity

這與MARTA等[23]研究的殼聚糖-膠原包覆磁性脂肪酶重復(fù)使用5次后仍保留80%～90%的酶活力，重復(fù)使用7次后可保留80%左右的酶活力的結(jié)果比較接近，且較吸附法固定化脂肪酶的重復(fù)利用穩(wěn)定性有較大的提高。這說(shuō)明此固定化工藝效果較好，酶和載體之間形成了相對(duì)較強(qiáng)的相互作用，經(jīng)過(guò)多次使用和洗滌后，其活性構(gòu)象仍能保持良好的狀態(tài)，具有良好的可重復(fù)利用性。

2.5 固定化脂肪酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Km值的大小通常與酶的性質(zhì)有關(guān)，通過(guò)Km值的大小可以得出酶與底物親和力的強(qiáng)弱。將底物的不同濃度[S]及測(cè)得的反應(yīng)的初始速度[V]代入米氏方程，如公式(3)、公式(4)所示：

(3)

由米氏方程變形得：

(4)

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明,1 000目蛭石改性后比表面積較大、孔徑結(jié)構(gòu)較豐富。脂肪酶的最佳固定化工藝為脂肪酶與載體質(zhì)量比為1∶1，溫度為25 ℃，吸附時(shí)間為3 h，海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為20 g/L，明膠的質(zhì)量濃度為5 g/L，CaCl2溶液濃度為0.04 mol/L，在此條件下脂肪酶活力回收率可達(dá)到82.77%；游離與固定化脂肪酶的最適催化溫度均為40 ℃，且固定化酶的熱穩(wěn)定性較好；固定化脂肪酶存儲(chǔ)56 d后仍能保留59.59%的酶活力，說(shuō)明其存儲(chǔ)穩(wěn)定性較好；固定化脂肪酶經(jīng)過(guò)7次重復(fù)回收利用后，酶活力仍可保留原來(lái)的85.33%，說(shuō)明其重復(fù)使用穩(wěn)定性較好。