美拉德交聯(lián)對乳清分離蛋白-酪蛋白酸鈉-普魯蘭多糖薄膜阻隔性及抗氧化性的改性研究

郄梓含，雷橋，2，3*，高文婧，曹慶龍

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

近年來，可降解和可食性食品包裝材料備受關(guān)注。其中，多糖和蛋白質(zhì)等可食用薄膜的優(yōu)勢已有了一定的研究[1-2]。乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)是一種高質(zhì)量的動(dòng)物全價(jià)蛋白，易于消化和吸收，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，含有多種必需氨基酸和生物活性成分。此外，乳清分離蛋白薄膜具有良好的機(jī)械性能和氧氣阻隔性能[3]。酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，NaCas)是一種可溶性的磷酸鈣化合物，其中含有人體所需的多種氨基酸和微量元素，具有良好的成膜性和水溶性[4]。普魯蘭多糖(pullulan)是一種水溶性微生物多糖，由金黃色芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生[5]；由普魯蘭多糖制成的薄膜無色透明，具有良好的阻氣性[6]、阻油性和熱封性，其涂層材料可用于水果和蔬菜的保鮮[7]，與其他有機(jī)聚合物材料相比，無毒且易于降解[8]。但是，單純的普魯蘭多糖薄膜易碎，為此，通常會添加混合其他物質(zhì)改良使用[9]。

美拉德反應(yīng)是一種非酶褐變，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。它是羰基化合物和氨基化合物之間的反應(yīng)，經(jīng)過復(fù)雜的過程后，會產(chǎn)生許多美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的功能性一直是研究的熱點(diǎn)。如，QIAN等[10]已經(jīng)研究了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性，以及OH等[11]研究了還原力和Fe2+螯合活性的方法。這些研究均發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)后抗氧化活性有所增加。KCHAOU等[12]還發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠改善魚明膠基薄膜的物理化學(xué)、感官和生物學(xué)特性。

本課題前期研究中，陳桂云等[13]研究了乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉和海藻酸鈉復(fù)合薄膜的包裝性能；尋倩男等[14]研究了酪蛋白酸鈉和明膠復(fù)合薄膜的包裝性能。與純蛋白薄膜相比，海藻酸鈉與明膠等多糖的添加，提高了薄膜的柔韌性、透光率等，但因?yàn)槎嗵潜旧淼膶傩裕苍龃罅吮∧さ乃苄?，降低了水蒸氣及氧氣阻隔性，限制了薄膜在食品包裝中的廣泛應(yīng)用。

為此，本研究擬通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-多糖美拉德反應(yīng)的改性方法，以期提高復(fù)合薄膜的疏水性、阻隔性并開發(fā)其抗氧化性等功能特性，從而進(jìn)一步拓展可食性薄膜的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(蛋白質(zhì)含量>98%)，Isopure公司(美國)；酪蛋白酸鈉(蛋白質(zhì)含量>99.21%)，上海麥克林生化科技有限公司(中國)；普魯蘭多糖(多糖含量>98%)，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；甘油，上?？犰`精細(xì)化工有限公司。

OX-TRAN 2/21氧氣透過率測試儀，美國膜康公司；Nicolet iS10傅立葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；S3400N型掃描電鏡，日本日立公司；U-3900分光光度計(jì)，日本日立公司；CR-400色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)公司；W-B-31D水蒸氣透過率測試儀，廣州西唐機(jī)電科技有限公司；XLW(EC)型智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南藍(lán)光機(jī)電技術(shù)有限公司；DF-101S磁力攪拌器，河南雨花儀器公司；DHG-9045A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；WGT-S透光率/霧度測試儀，上海精科有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薄膜的制備

將乳清分離蛋白，酪蛋白酸鈉和普魯蘭多糖分別溶解在去離子水中；用磁力攪拌器在室溫下連續(xù)攪拌2 h，直到完全溶解。將乳清分離蛋白溶液和酪蛋白酸鈉溶液置于85 ℃的水浴中攪拌30 min后以體積比1∶1混合，將混合后的蛋白溶液再與普魯蘭多糖溶液分別以體積比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1混合。在成膜溶液中加入35%(占成膜溶液干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油，并在室溫下攪拌60 min。將復(fù)合溶液真空脫氣，并將等量的溶液倒入平皿中，65 ℃的條件下，在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥6～8 h，干燥后，從平皿上揭下薄膜。隨后，將薄膜置于95 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中加熱24 h，以發(fā)生美拉德反應(yīng)。將薄膜在23 ℃、50% RH的條件下置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h以上，然后進(jìn)行薄膜的各項(xiàng)性能測試。將1∶1的未經(jīng)過加熱處理的薄膜作為對照組進(jìn)行研究。

1.2.2 薄膜厚度的測定

在每個(gè)薄膜樣品上選取5個(gè)點(diǎn)，采用螺旋測微器進(jìn)行測量，取其平均值作為薄膜的厚度值。在計(jì)算力學(xué)性能、透氣性能、透濕性能等性能時(shí)，采用該參數(shù)值。

1.2.3色度測量

根據(jù)KCHAOU等[12]的方法，使用色差儀測量薄膜的色度。獲得薄膜的L(亮度)，a(紅/綠)和b(黃/藍(lán))值。每個(gè)樣品測3次，取平均值計(jì)算。采用公式(1)計(jì)算色差(ΔE)：

(1)

式中：L，亮度；a，紅綠值；b，黃藍(lán)值；L′、a′、b′為標(biāo)準(zhǔn)白板的色度值(L′=94.16，a′=-0.48，b′=4.59)。

采用公式(2)計(jì)算薄膜的褐變指數(shù)(browning index，BI)：

(2)

式中:L,亮度；a,紅綠值；b,黃藍(lán)值。

1.2.4 光學(xué)性能測量

用透光率測試儀測量薄膜的透光率及霧度。根據(jù)夾樣器的尺寸將薄膜切好后放置在測試架上，使得光線垂直透過薄膜。每個(gè)樣品測3次，取平均值。

1.2.5 交聯(lián)度的測定

交聯(lián)度根據(jù)KCHAOU等[12]的方法進(jìn)行測量。其原理是使游離氨基與2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)反應(yīng)。具體方法為：在40 ℃的條件下，將約10 mg的薄膜浸入復(fù)合溶液中2 h，該復(fù)合溶液由1 mL的0.01% TNBS溶液和1 mL 4% NaHCO3溶液組成。然后，將2 mL 6 mol/L的HCl添加到該溶液中。溶液在60 ℃的條件下進(jìn)一步反應(yīng)90 min以充分水解。最后，用分光光度計(jì)在415 nm處測量溶液的吸光度。交聯(lián)度由公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：A，交聯(lián)薄膜的吸光度；A′，未交聯(lián)薄膜的吸光度。

1.2.6 薄膜微觀結(jié)構(gòu)

使用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的橫截面的微觀結(jié)構(gòu)。薄膜樣品浸入液氮中冷凍破碎，然后斷裂面朝上，垂直固定在樣品盤，并進(jìn)行噴金處理10 min。使用6 kV的加速電壓觀察所有樣品。

1.2.7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化

采用傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行FTIR分析。在測試期間，環(huán)境濕度保持在35%RH以下。將薄膜樣品制成合適的圓形，然后置于樣品架上進(jìn)行掃描。在400～4 000 cm-1掃描，掃描頻率為4 cm-1。

1.2.8 機(jī)械性能測量

采用電子拉力試驗(yàn)機(jī)測定膜樣品的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率。將樣品切成15 mm×120 mm的長條，初始距離設(shè)置為50 mm，速度為300 mm/min。每種樣品薄膜測量6次。通過公式(4)計(jì)算抗拉強(qiáng)度：

(4)

式中:TS,抗拉強(qiáng)度，MPa；F,薄膜斷裂時(shí)的最大拉力，N；S，薄膜的橫截面積，mm2。

1.2.9 氧氣透過率測定

采用氧氣透過率測試儀進(jìn)行測試。用樣品切割器將薄膜切成合適的大小，將氣源的壓力調(diào)節(jié)至0.5 MPa，薄膜兩側(cè)壓力為0.1 MPa，在恒定溫度23 ℃下測定薄膜的透氧率。所選的薄膜不應(yīng)有破損或氣泡。

1.2.10 水蒸氣透過率測定

薄膜的水蒸氣透過率(water vapor permeability，WVP)采用水蒸氣透過率測試儀進(jìn)行測試。用樣品切割器將薄膜切成合適的尺寸，樣品杯中放適量的氧化鈣，將樣品固定在樣品杯中后放置于測試腔中，采用增重法，相對濕度為90% RH，試驗(yàn)溫度為38 ℃。

水蒸氣滲透率的計(jì)算如公式(5)所示：

(6)

式中：G，質(zhì)量變化，g；t，時(shí)間，h；A，測試面積，m2；T，測試樣品的厚度，mm；ΔP，薄膜兩側(cè)的水蒸氣的分壓差。

1.2.11 抗氧化活性的測定

在評估美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性時(shí)，由于這些化合物的復(fù)雜性，必須使用多種測定方法[15]。因此，基于WPI-NaCas-Pullulan膜的DPPH自由基清除活性，還原能力和總抗氧化劑活性來確定其抗氧化活性。

1.2.11.1 清除自由基活性(free redical-scavenging activity，F(xiàn)RSA)

如KCHAOU等[12]的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分改進(jìn)，對薄膜的DPPH自由基清除活性進(jìn)行了測定。將薄膜分別切成小塊(m=20 mg)，放入離心管中，再分別加入1 000 μL的蒸餾水、750 μL的99.5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和250 μL的0.02 mmol/L DPPH的99%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液。將混合物在室溫下避光放置24 h后，采用分光光度計(jì)在517 nm處測量。除薄膜樣品外，對照組以相同方式進(jìn)行。FRSA計(jì)算如公式(6)所示：

(6)

式中：AC， DPPH溶液的吸光度；AS，包含薄膜樣品的DPPH溶液的吸光度；Ab，不添加DPPH溶液的包含膜樣品的空白管的吸光度。

1.2.11.2 還原能力

用MATMAROH等[16]的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分改進(jìn)，對薄膜的還原能力進(jìn)行測定。稱約10 μg樣品放于離心管中，分別加入0.5 mL蒸餾水、1.25 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.25 mL的10 g/100mL鐵氰化鉀，50 ℃水浴3 h。然后，取1 mL反應(yīng)溶液，加入500 μL的10 g/100mL三氯乙酸。將混合溶液以3 000 r/min離心10 min，將1.25 mL上清液與1.25 mL蒸餾水和0.25 mL 0.1 g/100mL氯化鐵混合。反應(yīng)10 min后，采用分光光度計(jì)在700 nm處測量所得溶液的吸光度值。反應(yīng)混合物的吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

1.2.11.3 總抗氧化活性

根據(jù)PRIETO等[17]的方法測定薄膜的總抗氧化活性。該方法是使用樣品在酸性條件下將Mo(Ⅵ)還原為Mo(Ⅴ)并形成綠色磷酸鹽/ Mo(Ⅴ)絡(luò)合物。將薄膜樣品切成30 mg的小塊放入離心管中，加入0.3 mL蒸餾水和3 mL試劑溶液(0.6 mol/L硫酸，28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨)。然后，將離心管密封并在90 ℃水浴下放置90 min。之后，將樣品冷卻至室溫，并在695 nm下測量其吸光度。按公式(7)將薄膜的總抗氧化活性表示為α-生育酚當(dāng)量：

A=0.011Ctoc+0.004 9R2=0.987

(7)

式中：A，薄膜在695 nm處的吸光度；Ctoc，以α-生育酚當(dāng)量計(jì)的濃度，μmol/mL。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并通過SNK方法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)[18]。Origin 9.0用于圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色度和光學(xué)特性的變化

經(jīng)過美拉德反應(yīng)后的薄膜的顏色從淡黃色變?yōu)樽厣?。棕色的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)和多糖美拉德反應(yīng)作用有關(guān)。整體來看，與對照組薄膜樣品相比，經(jīng)過處理的各組薄膜的L值均有下降；a、b值均有提高。ΔE提高了9.58～13.31倍(表1)。

表1 WPI-NaCas-pullulan薄膜的色度和光學(xué)特性

除了色度值外，褐變指數(shù)BI值也能表征美拉德反應(yīng)的程度[19]。與對照組薄膜相比，各組經(jīng)過處理后的薄膜的BI值提高了8.27～15.15倍。通過顏色變化，可以得知復(fù)合蛋白質(zhì)與普魯蘭多糖比例為1∶3(體積比)時(shí)，美拉德反應(yīng)最為劇烈。

純的普魯蘭多糖膜無色透明，與乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉混合成膜后透光率降低，霧度均提高；經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，薄膜顏色變?yōu)樽厣?，各組薄膜的透光率進(jìn)一步降低8.76%～29.99%，產(chǎn)生了避光作用，可應(yīng)用于需避光保存及易氧化的物品包裝。

2.2 交聯(lián)度變化

圖1顯示了WPI -NaCas-pullulan薄膜的交聯(lián)度，該方法基于非交聯(lián)薄膜和交聯(lián)薄膜中游離氨基的測定。在美拉德反應(yīng)的早期，含游離氨基的蛋白質(zhì)，如賴氨酸的ε-NH2基團(tuán)，會與普魯蘭多糖的羰基反應(yīng)，導(dǎo)致游離氨基的損失[20]。這種交聯(lián)的定量化學(xué)方法證實(shí)了而后討論的定性FTIR數(shù)據(jù)，表明了在熱處理后通過還原糖使糖基化。對于1∶3組經(jīng)處理后的薄膜，交聯(lián)度達(dá)到最大約84.033%。從該結(jié)果來看，比例為1∶3、3∶1的膜的交聯(lián)度高于其他組。這可能是因?yàn)槎嗵桥c蛋白質(zhì)分別在反應(yīng)中過量，可以完全反應(yīng)。并且過量的多糖可作為增塑劑，這對交聯(lián)度、機(jī)械性能和阻隔性能都有影響。

圖1 不同比例的WPI -NaCas-pullulan薄膜的交聯(lián)度Fig.1 Degree of crosslinking of WPI-NaCas-pullulan-based films of different ratios注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 薄膜的微觀結(jié)構(gòu)

圖2是WPI-NaCas-pullulan薄膜橫截面的電鏡圖。由圖2可以看出，圖2-a顯示的對照組薄膜截面粗糙、有較多褶皺和孔洞；圖2-b和圖2-c顯示的實(shí)驗(yàn)組薄膜截面褶皺較少，光滑且致密，孔洞較少。由此可知，經(jīng)過美拉德反應(yīng)處理的薄膜截面光滑、致密且孔洞較少。由B、D組間對照，可看出，普魯蘭多糖添加量越多，截面越光滑致密，這與交聯(lián)度和阻氧性變化的結(jié)果相一致。

a-A組薄膜(對照組);b-B組薄膜;c-D組薄膜圖2 不同比例的WPI -NaCas-pullulan薄膜的電鏡圖Fig.2 The SEM photograph of WPI-NaCas-pullulan-based films of different ratios

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化

圖3 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的FTIR光譜Fig.3 FTIR spectra of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.5 機(jī)械性能

由于美拉德反應(yīng)的作用，各組薄膜的抗拉強(qiáng)度值顯著提高(圖4)。與未處理薄膜相比，F(xiàn)組薄膜的抗拉強(qiáng)度與對照組相比，提高了約2.42倍；在各組薄膜中，WPI-NaCas主要賦予材料強(qiáng)度硬度，pullulan則賦予材料塑性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組樣品中，抗拉強(qiáng)度最大的為F組，這是因?yàn)樵摻M的交聯(lián)度較高，且WPI-NaCas含量較高，pullulan含量低，薄膜的硬度和脆度增大。然而，隨著薄膜強(qiáng)度、硬度的提高，其彈塑性下降，因而，美拉德反應(yīng)導(dǎo)致了薄膜斷裂伸長率不同程度的下降。

圖4 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的機(jī)械性能Fig.4 Mechanical properties of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.6 阻氧性能的變化

由圖5可以看出，熱處理24 h后，由于美拉德反應(yīng)的交聯(lián)作用，薄膜的氧氣透過率均顯著低于對照組薄膜，氧氣透過率降低了54.46%～94.19%。其中，B組體現(xiàn)出最優(yōu)的阻氧性能，這可能是因?yàn)樽懔康亩嗵浅洚?dāng)了交聯(lián)劑和增塑劑，并通過分子間和分子內(nèi)折疊產(chǎn)生了異常緊密的結(jié)構(gòu)。

圖5 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的氧氣透過率Fig.5 Oxygen transmission rate of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.7 水蒸氣透過率

復(fù)合蛋白膜親水性導(dǎo)致的高水蒸氣透過率一直是限制其應(yīng)用的因素之一[21]。通過美拉德反應(yīng)改性，薄膜的水蒸氣透過率顯著降低了61.07%～94.40%(圖6)。美拉德反應(yīng)使蛋白質(zhì)分子和多糖分子緊密交聯(lián)，顯著提高了薄膜的疏水性，使得復(fù)合蛋白膜的應(yīng)用前景更為廣闊。

圖6 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的水蒸氣透過率Fig.6 Water vapor permeability of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

2.8 美拉德反應(yīng)活化膜的抗氧化性能

WPI-NaCas-pullulan基薄膜的DPPH自由基清除活性如圖7所示。與對照組相比，所有實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的清除自由基活性。薄膜清除DPPH自由基的能力是由于其氫原子轉(zhuǎn)移能力，在經(jīng)過美拉德反應(yīng)之后明顯增加。B組表現(xiàn)出較高的DPPH自由基清除能力，達(dá)到85.613%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有貢獻(xiàn)氫原子的能力，從而穩(wěn)定了自由基。

圖7 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging ability of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

WPI-NaCas-pullulan復(fù)合膜將三價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)化為亞鐵離子的能力如圖8所示，結(jié)果表明，對照組在700 nm處的吸光度最初分別為1.275，還原能力在美拉德反應(yīng)后，各組吸光度分別提高到6.853、3.867、3.685、3.715和4.265。圖9顯示美拉德反應(yīng)活化處理后的薄膜顯示出較高的抗氧化活性，分別達(dá)到約489.706、283.524、256.788、261.797和467.433 μmol/mL當(dāng)量的α-生育酚，抗氧化活性分別為對照組的2.75～5.23倍。

圖8 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的還原力Fig.8 Reducing power of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

圖9 不同比例的WPI-NaCas-pullulan薄膜的總抗氧化活性Fig.9 Total antioxidant activity of WPI-NaCas-pullulan films of different ratios

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照組薄膜樣品也存在一定的抗氧化性，這可能是因?yàn)樵诔跫壉∧ず娓蛇^程中，在較低的溫度條件下，已經(jīng)有微弱的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。

3 結(jié)論

采用熱處理誘導(dǎo)美拉德反應(yīng)活化改性的方法，大大改善了WPI-NaCas-pullulan薄膜的性能，顯著提高了薄膜的疏水性、交聯(lián)度及阻隔性，并賦予了薄膜優(yōu)良的抗氧化活性。各樣品中，當(dāng)WPI-NaCas/pullulan體積比為1∶3時(shí)，薄膜的美拉德反應(yīng)最為劇烈，改性效果最為顯著：交聯(lián)度達(dá)84.033%，氧氣透過率為0.043 cm3/(m2·d)，水蒸氣透過率為8.4×10-13g·cm/(cm2·s·Pa)，DPPH自由基清除率為85.613 %，還原力OD700nm為6.853，總抗氧化活性表現(xiàn)出489.706 μmol/mL當(dāng)量的α-生育酚。

基于美拉德改性后的WPI-NaCas-pullulan薄膜具有良好的阻氧性及抗氧化性，可應(yīng)用于包裝油脂、肉類以及部分干物料。若將其應(yīng)用在方便食品調(diào)味包內(nèi)包裝中，則既可防止油脂氧化，又由于薄膜有水溶性，極大減少了包裝廢棄物。為了更好地延長食品的貨架期，將其與氣調(diào)包裝相結(jié)合，未來將在食品保藏領(lǐng)域發(fā)揮更廣闊的作用。