具有高細胞黏附性及高生物膜形成能力的植物乳桿菌有效抑制小鼠體內(nèi)空腸彎曲桿菌毒力因子的轉錄活性

金星，賀禹豐，周永華，陳曉華，王剛*，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(國家衛(wèi)生健康委寄生蟲病預防與控制技術重點實驗室，江蘇 無錫，214064) 3(衡陽師范學院 生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽，421008)

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)為革蘭氏陰性菌，是彎曲桿菌屬的一種。空腸彎曲桿菌作為一種常見的人畜共患食源性病原菌，它的感染會引發(fā)急性的腹痛及腹瀉[1]?？漳c彎曲桿菌的flaA基因調控著鞭毛蛋白的表達，flaA表達的降低會使得鞭毛縮短并喪失運動能力，導致其黏附和侵入宿主腸道細胞的能力顯著下降。cdtB基因調控著空腸彎曲桿菌細胞致死性膨脹毒素的分泌表達，而空腸彎曲桿菌的侵入抗原蛋白由ciaB基因編碼表達，其基因表達的下降會阻礙空腸彎曲桿菌進入細胞繁殖的擴散。pldA基因調控著空腸彎曲桿菌磷脂酶活性蛋白，其和空腸彎曲桿菌的侵入和定植密切相關。

到目前為止，對于空腸彎曲桿菌的治療，還是以抗生素為主，但對抗生素的過度依賴必然會導致具有抗生素抗性的空腸彎曲桿菌種類及數(shù)目的增加。乳酸菌，能夠在人體腸道內(nèi)有效定植并在維持腸道功能和宿主健康方面發(fā)揮至關重要的作用，同時，能夠緩解由幽門螺桿菌、大腸桿菌以及沙門氏菌等病原菌引起的感染的研究也已經(jīng)被報道[2-4]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于眾多乳酸菌中的一個種屬，由于其自身良好的益生特性及生物學特性(包括具有良好的耐受酸、膽鹽、滲透壓、溫度、氧化、饑餓等脅迫的能力)，被廣泛應用于乳制品及發(fā)酵制品中[5-10]。已有研究表明，植物乳桿菌可以有效拮抗空腸彎曲桿菌的感染，如體外抑制空腸彎曲桿菌的生長，下調小鼠感染空腸彎曲桿菌后體內(nèi)的炎癥因子水平，降低肉雞飼養(yǎng)中空腸彎曲桿菌的污染程度等[11-13]。

本文考察了12株植物乳桿菌的生長速率、產(chǎn)酸能力、對HT-29細胞的黏附能力、自我形成生物膜的能力、表面疏水性以及耐酸耐膽鹽的能力等一系列的生物學特性，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的差異性，隨后將其分別干預小鼠并考察其在宿主體內(nèi)對空腸彎曲桿菌毒力基因表達的影響，結合生物學特性和毒力基因表達的相關性分析，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能在小鼠體內(nèi)顯著降低空腸彎曲桿菌毒力基因的表達很可能歸結于其表面高疏水性所帶來的高黏附性及菌株自身較強的生物膜形成能力。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及小鼠

驗所采用的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)編號及來源詳見表1，植物乳桿菌、空腸彎曲桿菌NCTC 11168及人結腸癌細胞株HT-29，均來自于江南大學食品學院生物技術中心菌種庫。

表1 實驗所用12株植物乳桿菌Table 1 12 Lactobacillus plantarum strains used in the study

實驗小鼠采用C57BL/6品系，SPF級，雌性，3周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，于江蘇省血吸蟲病防治研究所動物房中分籠飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；腦心浸液肉湯(BHI)、哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，Oxoid(英國)公司；無菌綿羊血，杭州新銳生物工程有限公司；胎牛血清，HyClone(美國)公司；青霉素/鏈霉素溶液以及慶大霉素，上海生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco(美國)公司；Prime Script 1st Strand c DNA Synthesis Kit，TaKaRa(美國)公司；i TaqTMUniversal SYBR?Green Supermix，BIO-RAD(美國)公司。

人工胃液：取濃度1 mol/L稀HCl 16.4 mL，加水稀釋至50 mL，調節(jié)pH至2.0，然后按照每100 mL溶液為1 g胃蛋白酶的比例，加入胃蛋白酶，充分溶解后再用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌。

人工腸液：稱取6.8 g KH2PO4，加蒸餾水500 mL進行溶解，調節(jié)pH至6.8，加水至1 000 mL，然后按照每100 mL溶液為0.3 g牛膽鹽和1 g胰蛋白酶的比例，加入牛膽鹽和胰蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌。

1.3 儀器與設備

生物安全柜，Labconco(美國)公司；5415R小型臺式高速離心機，eppendorf(德國)公司；starter3100 pH計，ohaus(美國)公司；BD150L三氣培養(yǎng)箱，Bingd(德國)公司；凝膠成像儀 Universal hood Ⅱ，美國伯樂(Bio-Rad)公司；酶標儀，Thermo(美國)公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；Leica DM2000顯微鏡，Leica光學儀器(日本)公司；S ME3002E/02電子天平，上海METTLER TOLEDO儀器有限公司；Bio-Rad ? CFX96TM實時熒光定量PCR儀，Bio-Rad(美國)公司。

1.4 細菌菌懸液及上清液的制備

在液體MRS中按照2%的接種量接種乳酸菌，37 ℃下培養(yǎng)24 h為1代，傳代2次，8 000 r/min，6 min，4 ℃條件下離心，收集發(fā)酵上清液及菌體。用PBS清洗2次菌體，重懸，調整所需濃度備用；采用 0.22 μm無菌微孔濾膜對上清液進行過膜處理，4 ℃冰箱保存。

1.5 乳酸菌生長速率及產(chǎn)酸能力的測定

生長速率的測定：在液體MRS中按照2%的接種量接種乳酸菌，37 ℃下培養(yǎng)，靜置，每隔2 h取樣，在600 nm條件下測定其吸光度。

產(chǎn)酸能力的測定：將pH計探頭插入處理完成的乳酸菌上清液中，測定其pH值。

1.6 乳酸菌對HT-29細胞的黏附實驗

將生長融合至80%的HT-29細胞消化，將蓋玻片放置在6孔培養(yǎng)板中，加入2 mL/孔的細胞完全培養(yǎng)懸液(1×105個/mL)，37 ℃條件下放入5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL/孔的乳酸菌菌懸液(1×108CFU/mL)，補加基礎細胞培養(yǎng)液至2 mL，隨后孵育2 h。結束后，用磷酸鹽緩沖液清洗以除去未黏附的乳酸菌，甲醇固定20 min后進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。隨機選取20個視野計算每100個細胞所黏附的細菌數(shù)目，即為黏附指數(shù)。

1.7 乳酸菌自身生物膜形成量的測定

根據(jù)姚沛琳[14]的實驗方法測定乳酸菌生物膜的形成量。

1.8 乳酸菌表面疏水性的測定

根據(jù)KOS等[15]的實驗方法測定乳酸菌表面疏水性。

1.9 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測定

根據(jù)俞赟霞[16]的實驗方法稍作改動測定乳酸菌耐酸耐膽鹽的能力。選取乳酸菌數(shù)量級為109CFU/mL 的磷酸鹽緩沖液進行本實驗，離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，加入等體積的模擬人工胃液，水浴(37 ℃)中培養(yǎng)3 h，取樣，使用梯度稀釋法進行平板菌落計數(shù)后，相同條件離心，重懸于等體積的人工腸液，水浴(37 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)，2 h和4 h分別取樣計數(shù)。

1.10 動物實驗

(1)小鼠分組及處理

5～6只小鼠為1組，300 μL/只為小鼠的灌胃劑量。第1天，對小鼠灌胃弓形蟲，弓形蟲灌胃劑： 300 μL含20個包囊的弓形蟲腦勻漿懸液[17-18]；第2、3、4天正常飼養(yǎng)；第5、6天對小鼠分別灌胃空腸彎曲桿菌菌懸液和乳酸菌菌懸液，間隔1 h；第7、8、9、10天正常飼養(yǎng)，小鼠表現(xiàn)出空腸彎曲桿菌感染癥狀；第11天小鼠處死。

(2)乳酸菌干預后盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲桿菌毒力因子的表達

刮取小鼠盲腸中的內(nèi)容物，參考MUNDI等[19]的實驗方法提取總RNA后，根據(jù)PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書操作步驟逆轉錄合成cDNA。后采用qRT-PCR技術檢測模板中的空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白flaA基因、編碼全毒素cdtB基因、原侵入蛋白ciaB基因以及磷脂酶活性蛋白pldA基因。毒力基因PCR引物如表2所示。

表2 實驗所用毒力基因及PCR引物Table 2 Target virulence genes and primers used in the study

qRT-PCR的反應體系為：iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 10 μL;上游引物(10 μmol/L) 1 μL;下游引物(10 μmol/L) 1 μL;cDNA模板 1 μL;dd H2O 7 μL。

空腸彎曲桿菌毒力基因q RT-PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s(40個循環(huán))。

得到的數(shù)據(jù)進行定量計算，重復3次。

1.11 統(tǒng)計與繪圖

采用SPSS對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、相關性分析，繪圖采用Origin 8.5、Graphpad Prism 6以及Tbtools完成。所有實驗結果表示為Mean±SD。不同小寫字母(a～f)表示P<0.05。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌生長速率的測定

本研究考察了12株植物乳桿菌在液體MRS中按照2%的接種量接種后，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)時的生長曲線，結果如圖1所示。

圖1 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 The growth curves of Lactobacillus plantarum strains in MRS

由圖1結果可知，12株植物乳桿菌的生長在MRS培養(yǎng)體系中速度較快，培養(yǎng)12～16 h之后，菌株基本上已經(jīng)完全進入了穩(wěn)定期。以上結果表明植物乳桿菌活力旺盛，作為兼性厭氧菌，無論氧氣存在與否，都能保持較高的生長活力，這為其在嚴苛的條件下生長、繁殖提供了源動力。有研究表明，乳酸菌在生長過程中，會受到各種因素的影響，比如說有機酸、氧氣及滲透壓等，復雜的條件會影響乳酸菌的生長速率及數(shù)量級[20]。而本文中的植物乳桿菌活力旺盛且生長速率較快，也反映了其具有良好的耐酸及滲透壓的潛力。

2.2 植物乳桿菌產(chǎn)酸能力的測定

本研究利用發(fā)酵上清液的pH值表征乳酸菌的產(chǎn)酸能力，考察了12株植物乳桿菌培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生有機酸的能力，實驗結果如表3所示。

表3 植物乳桿菌發(fā)酵上清液pH值Table 3 The resoults of pH for Lactobacillusplantarum cell free supernatant

由表3結果可知，12株植物乳桿菌的培養(yǎng)完成后發(fā)酵上清液的pH值在4.67～3.80。雖然不同菌株間存在差異，但是偏低的pH值反映了植物乳桿菌在培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生了有機酸，pH值的不同可能是由于有機酸的種類及數(shù)量不同所造成的。乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸已被證明可以抑制食源性致病菌的生長，特別是乳酸，作為乳酸菌生長產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，顯著降低了乳酸菌培養(yǎng)后體系的pH值，并能夠顯著抑制幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)尿素酶的活性，從而降低幽門螺旋桿菌的活力并抑制其生長[21]。植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸為其具備一定的抗菌能力提供了條件。

2.3 植物乳桿菌對HT-29細胞的黏附效果

黏附，作為乳酸菌與宿主細胞作用的先決條件，是乳酸菌在機體內(nèi)展現(xiàn)對宿主有益作用的基礎，同樣，良好的黏附性也為乳酸菌在體內(nèi)生長和定植提供必要的動力。本研究考察了12株植物乳桿菌對HT-29細胞的黏附能力，實驗結果如圖2所示。

由圖2結果可知，雖然同為植物乳桿菌，但是對HT-29細胞的黏附能力卻體現(xiàn)出非常明顯的種內(nèi)差異，N36、N40以及ZL4有著優(yōu)越的黏附效果，其黏附指數(shù)均值均達到12以上，而ZX7卻幾乎不具備任何的黏附能力。而本研究中具有良好黏附效果的植物乳桿菌很有可能在抵御病原微生物方面也表現(xiàn)出相應的優(yōu)勢。WANG等[22]發(fā)現(xiàn)LactobacillusplantarumN8在體外實驗中對HT-29細胞的黏附指數(shù)為10左右，體現(xiàn)出較強的黏附效果，正因如此，該菌株對空腸彎曲桿菌的生長具有抑制作用，這說明植物乳桿菌對細胞的良好黏附作用可以緩解病原菌對宿主的侵襲，我們的實驗結果與之相類似，也暗示著N36、N40、 ZL4等具有優(yōu)良黏附作用的菌株具有抑制空腸彎曲桿菌的生長、緩解其對宿主感染的潛力。

2.4 植物乳桿菌自身生物膜形成的能力

在潮濕溫暖的環(huán)境中，某些乳酸菌會形成生物膜，生物膜的形成使得乳酸菌擁有諸如良好的穩(wěn)定性及抗逆性的特質。本研究考察了12株植物乳桿菌自身生物膜形成的能力，實驗結果如圖3所示。

圖3 十二株植物乳桿菌自身生物膜形成能力Fig.3 Biofilm formation of 12 Lactobacillusplantarum strains

圖3結果表明，在595 nm處的吸光度代表了菌株自身生物膜的形成量，N29、N34、N36、ZL4和M47都具有較強的自身成膜能力，而N38、ZL3以及ZX7卻幾乎不具備生物膜的形成能力，由此可見植物乳桿菌自我成膜能力也體現(xiàn)出明顯的種內(nèi)差異。與本實驗結果相似的是，王剛等[23]的研究發(fā)現(xiàn)， OD595達到3以上的乳酸菌，認定為具有良好的生物膜形成能力，能夠有效降低空腸彎曲桿菌在小鼠體內(nèi)的定植量，緩解空腸彎曲桿菌在哺乳動物體內(nèi)的感染。

2.5 植物乳桿菌表面疏水性的分析

12株植物乳桿菌表面的疏水性也得到了測定，實驗結果如表4所示。

表4 植物乳桿菌的表面疏水性Table 4 The surface hydrophobicity of Lactobacillusplantarum strains

由表4結果可知，12株植物乳桿菌表面疏水性在27.36%～68.14%，N36、N40、ZL4展現(xiàn)出較高的表面疏水性。趙煜[24]的研究指出，植物乳桿菌N9具有較高的疏水性，為(51.97±2.37) %，并且N9同樣具有著較強的對細胞的黏附能力，同時有研究報道指出雙歧桿菌擁有黏附上皮細胞的能力很大程度上取決于其具備良好的表面疏水性[25]。結合黏附實驗的相關數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)N36、N40、ZL4同時具備較高的表明疏水性和對HT-29細胞黏附能力，這也反映了該2項指標具有很高的相關性。乳酸菌表面的蛋白或類蛋白物質，會使其具有較高的疏水性，此類物質易發(fā)生非特異性的相互作用，使得菌體更易于黏附細胞并對細胞形成保護作用[26]。

2.6 植物乳桿菌的耐酸耐膽鹽能力

本實驗采用12株植物乳桿菌依次通過人工胃液及腸液并在其中停留一段時間的方法，考察其耐酸耐膽鹽的能力，結果如圖4所示。

圖4 十二株植物乳桿菌耐酸耐膽鹽能力Fig.4 Resistance of 12 Lactobacillus plantarum strains to gastric acid and bile salts

由圖4結果可知， 多數(shù)植物乳桿菌在經(jīng)歷了人工胃液及人工腸液的培養(yǎng)之后，活菌數(shù)仍可以達到約8 lgCFU/mL，與初始的9 lgCFU/mL濃度相比，下降了約一個數(shù)量級。N31、ZL3體現(xiàn)出較差的耐受效果，培養(yǎng)后活菌數(shù)下降至低于6 lgCFU/mL。很多學者發(fā)現(xiàn)，一些具有良好的耐酸耐膽鹽特性的植物乳桿菌，在調節(jié)慢性代謝性疾病或者是拮抗胃腸道病原菌感染方面，都有著突出的表現(xiàn)[27-28]。

2.7 植物乳桿菌在體內(nèi)影響空腸彎曲桿菌毒力因子的表達

本文中，由于空腸彎曲桿菌NCTC 11168偏弱的致病性使其無法在腸道中大量定植并發(fā)揮毒力作用，弓形蟲感染模型被引入用于破壞健康小鼠的免疫力[29]。研究測定了12株植物乳桿菌干預小鼠后盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲桿菌毒力因子flaA、cdtB、ciaB和pldA的表達，結果如圖5所示。

由圖5結果可知，不同植物乳桿菌在小鼠體內(nèi)抑制空腸彎曲桿菌毒力因子表達的效果不一，多數(shù)菌株對flaA在體內(nèi)的表達均產(chǎn)生了一定的影響，但是在ciaB的表達水平上，能產(chǎn)生抑制作用的菌株卻比較少，這說明不同菌株在小鼠體內(nèi)影響空腸彎曲桿菌的感染機制可能存在顯著的個體差異。綜合圖5的實驗結果，N36和ZL4在體內(nèi)展現(xiàn)出更強的對空腸彎曲桿菌毒力因子的抑制效果。也有文獻報道羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)X13預防小鼠感染空腸彎曲桿菌后，盲腸段部分毒力基因的表達得到了顯著的下調，部分毒力基因下調近1倍左右[30]，該研究成果也驗證了本文中部分植物乳桿菌在小鼠體內(nèi)抑制空腸彎曲桿菌毒力因子表達的合理性。

a-flaA基因表達;b- cdtB基因表達;c-ciaB基因表達;d-pldA基因表達圖5 十二株植物乳桿菌在小鼠體內(nèi)對空腸彎曲桿菌毒力基因表達的影響Fig.5 Effects of 12 Lactobacillus plantarum on virulence genes expression in C. jejuni in mice

2.8 植物乳桿菌生物學特性和其干預后空腸彎曲桿菌毒力基因在體內(nèi)表達的相關性分析

為了探究菌株自身的生物學特性和其在體內(nèi)緩解空腸彎曲桿菌感染是否存在聯(lián)系，本文對12株植物乳桿菌生物學特性和其干預后空腸彎曲桿菌毒力基因的表達進行了相關性的分析，結果如圖6所示。

a-不同生物學特性與毒力基因熱圖分析;b-不同生物學特性與毒力基因的相關性分析圖6 植物乳桿菌生物學特性和其干預后空腸彎曲桿菌毒力基因在體內(nèi)表達的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between biological characteristics of Lactobacillus plantarum and expression of virulence genes Campylobacter jejuni virulence genes after intervention in mice

植物乳桿菌的不同生物學特性與flaA、cdtB、ciaB和pldA制作了熱圖，另外，氣泡圖被用來展現(xiàn)菌株的生物學特性和各毒力因子之間的相互關系。由圖6結果可知，總體來說，各毒力因子和黏附能力、生物膜形成能力以及表面疏水性的相關性較高，而菌株較高的表面疏水性又使得其獲得了良好的對上皮細胞的黏附效果，這意味著就植物乳桿菌而言，菌體表面高疏水性所帶來的高黏附性及菌株自身較強的生物膜形成能力使得其能在小鼠體內(nèi)顯著降低空腸彎曲桿菌毒力基因的表達，從而緩解空腸彎曲桿菌在體內(nèi)的感染?？漳c彎曲桿菌的部分致病機制來自于其鞭毛蛋白，而某些毒力因子(例如flaA)調控其合成與轉錄，而且鞭毛蛋白也影響著空腸彎曲桿菌的黏附與定植，乳酸菌對腸上皮細胞的高黏附性會抑制flaA及flaB的分泌表達，從而降低空腸彎曲桿菌的運動性及病原毒力蛋白的運轉功能[31-32]。侵入抗原蛋白和磷脂酶活性蛋白也與空腸彎曲桿菌侵入細胞破壞宿主細胞腸道屏障密切相關，乳酸菌良好的成膜能力使其更易在宿主腸道中富集并定植，乳酸菌優(yōu)先于病原占位位點后，調控ciaB和pldA的分泌表達，修護腸道黏膜屏障，極大程度地阻礙病原菌與腸黏膜之間的黏附與侵襲[33]。某些嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)由于其獨特的生理學特性使得其在調控侵襲性大腸桿菌及幽門螺旋桿菌的毒力基因表達上體現(xiàn)出良好的效果[34-35]。

3 結論

本文考察了12株植物乳桿菌的生長速率、產(chǎn)酸能力、對HT-29細胞的黏附能力、自我形成生物膜的能力、表面疏水性以及耐酸耐膽鹽的能力等一系列的生物學特性，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的差異性，隨后將其分別干預小鼠并考察其在宿主體內(nèi)對空腸彎曲桿菌毒力基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)N36和ZL4可以顯著降低空腸彎曲桿菌毒力基因的表達，結合生物學特性和毒力基因表達的相關性分析，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能在小鼠體內(nèi)顯著降低空腸彎曲桿菌毒力基因的表達很可能歸結于其高表面疏水性所帶來的高黏附性及菌株自身較強的生物膜形成能力，這為構建可以在體內(nèi)緩解空腸彎曲桿菌感染的植物乳桿菌的體外篩選方法提供了新的思路。