過表達pls基因結(jié)合前體流加提高小白鏈霉菌ε-聚賴氨酸產(chǎn)量

汪澤，王開方，胡揚帆，毛忠貴，陳旭升*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是于1977年在小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種同型氨基酸聚合物，其分子結(jié)構(gòu)是由25～35個L-賴氨酸單體通過ε-氨基和α-羧基脫水縮合而成[1]。因其能在pH 6～8環(huán)境中有效抑制G+/G-細菌、酵母菌和霉菌生長，甚至對一些耐熱性芽孢桿菌和病毒也有明顯抑制作用[2-3]，故展現(xiàn)出廣泛的抑菌活性，被作為防腐劑應用于食品、化妝品、紡織、皮革和造紙等領域[4-5]。另外，作為多陽離子生物聚合物，ε-PL還被用作藥物載體、芯片包被材料等[6-7]。因此，ε-PL是一種具有較大市場需求和經(jīng)濟價值的新型生物發(fā)酵產(chǎn)品。

提高ε-PL發(fā)酵水平以降低其生產(chǎn)成本是推動ε-PL 在上述領域被廣泛應用的重要前提。因此，獲得1株發(fā)酵產(chǎn)量高、工業(yè)屬性強的ε-PL生產(chǎn)菌是過去40多年來的研究重點。HIRAKI等[8]于1998年借助物理/化學誘變結(jié)合S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸和甘氨酸雙重抗性篩選，通過20多年的反復選育獲得1株ε-PL高產(chǎn)突變菌株S.albulus11011A，其搖瓶產(chǎn)量達到2.11 g/L，較出發(fā)菌提高了10倍。通過進一步發(fā)酵工藝的優(yōu)化，實現(xiàn)192 h連續(xù)發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量達到48.3 g/L[9]。本研究團隊，自2000年開始，綜合利用物理/化學誘變、基因組重排[10]、核糖體工程和抗性篩選[11]等策略，選育獲得一系列ε-PL高產(chǎn)菌株，其中S.albulusGS114搖瓶產(chǎn)量達到3.0 g/L(較出發(fā)菌株提高了近10倍)，5 L發(fā)酵罐產(chǎn)量達到53.5 g/L(192 h)[12]。盡管傳統(tǒng)誘變選育實現(xiàn)了生產(chǎn)菌ε-PL合成能力的大幅度提高，但選育時間長、工作量繁重和不確定性因素多，成為進一步提高生產(chǎn)菌ε-PL合成能力的瓶頸。隨著基因工程和組學技術的發(fā)展，利用代謝工程手段改造ε-PL生產(chǎn)菌成為一種有效的方法[13-15]。

已有的研究資料顯示，ε-PL生物合成是以L-賴氨酸作為前體、ATP作為輔因子，在ε-PL合成酶(Pls)催化下形成ε-PL[16]。那么，通過在S.albulus中過表達pls是否能夠提高ε-PL產(chǎn)量？令人遺憾的是，目前國內(nèi)外還未見相關報道。本研究首先構(gòu)建pls過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls，再通過外源添加L-賴氨酸和ATP強化前體和能量輔因子供給，以嘗試提高S.albulusM-Z18的ε-PL合成能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所使用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。目的基因擴增引物及qRT-PCR驗證引物如表2所示。

表2 本研究中使用的引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.1.2 酶與試劑

菌株構(gòu)建酶和試劑盒：限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、片段純化試劑盒、感受態(tài)制備試劑盒，TaKaRa；一步克隆試劑盒、Phanta酶，南京諾唯贊生物科技有限公司。

qRT-PCR相關試劑盒：B511321 Trizol 總RNA抽提試劑盒、UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，上海生工；GeneRuler DNA Ladder Mix、Maxima Reverse Transcriptase，Thermo Scientific。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)基分別選用BTN和M3G培養(yǎng)基[17]；搖瓶、分批、補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基(RSM培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.8， FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO44，pH 6.8；LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 5，pH 7.0；MS培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 20，黃豆粉 20，瓊脂 20，pH自然。滅菌后加入MgCl2至終濃度10 mmol/L；YT培養(yǎng)基(2×)(g/L)：胰蛋白胨 16，酵母粉 10，NaCl 5，pH 7.0; TAE緩沖液(50×)(g/L)：Tris 242，EDTA 18.612，冰醋酸 57.1 mL，pH 8.3。

1.1.4 儀器與設備

AB204-N分析天平，瑞士梅特勒公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海光都儀器設備有限公司；HYL-C組合式搖床，太倉市強樂設備有限公司；3K15高速冷凍離心機，德國西格瑪公司；UV-2100分光光度計，優(yōu)尼科儀器有限公司；GI100T高壓蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司；C1000 Touch PCR儀、Gel Doc EZ 凝膠成像儀,BIO-RAD；DYCP-31DN 電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取2～3環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h左右。

搖瓶發(fā)酵：將培養(yǎng)20 h左右的種子液按照8%(體積分數(shù))接種量接入RSM培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)約24 h后(pH值下降至4.0左右)，加入預調(diào)pH為4.0的L-賴氨酸和ATP母液至終濃度分別為5 g/L和1.0 mmol/L，繼續(xù)發(fā)酵至96 h結(jié)束。

發(fā)酵罐發(fā)酵：在5 L發(fā)酵罐中裝入3.5 L RSM培養(yǎng)基，發(fā)酵開始前將初始pH調(diào)至6.8，接種后pH自然下降，當pH降至pH 3.6～4.0時，加入預調(diào)pH 4.0 的L-賴氨酸和ATP母液，并一直維持L-賴氨酸質(zhì)量濃度為5.0 g/L、ATP濃度為1.0 mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。同時，利用氨水將pH值控制在3.6～4.0直至發(fā)酵結(jié)束,其他參數(shù)按許永杰等[18]的方式控制。

上述培養(yǎng)基中均加入安普霉素至終質(zhì)量濃度50 μg/mL。

1.2.2 感受態(tài)細胞制備

參照TaKaRa大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒說明書。

1.2.3 接合轉(zhuǎn)移及重組子的鑒定

從-80 ℃冰箱中取出保藏含過表達載體的E.coliET12567/pIB139甘油管，劃線分離后，30 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到含5 mL LB液體培養(yǎng)基(安普霉素50 μg/mL，氯霉素和卡那霉素25 μg/mL)的試管中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。以1%(體積分數(shù))接種量轉(zhuǎn)接新鮮的含相同抗生素的LB試管，相同條件培養(yǎng)至OD600達到0.4左右，冰浴5 min后離心棄上清，菌體沉淀用預冷的不含抗生素的LB培養(yǎng)基洗滌2次后，重懸于0.5 mL 2×YT培養(yǎng)基中，置于冰上備用。S.albulusM-Z18孢子制備：取生長8 d的平板，將整個平板上的孢子全部刮到10 mL無菌水中，玻璃珠充分打散后用脫脂棉過濾制備成孢子懸浮液。取250 mL孢子懸浮液加入到250 mL 2×YT的培養(yǎng)基中并混合均勻，50 ℃熱激10 min后，于37 ℃搖床，200 r/min預萌發(fā)2.5 h(或孢子剛剛萌發(fā)出芽管)。將上述的0.5 mL大腸桿菌和0.5 mL預萌發(fā)的孢子混合在一起，離心濃縮至100 μL涂布MS培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)18 h。隨后，覆蓋安普霉素和萘啶酮酸，終濃度分別為50和25 μg/mL。相同條件，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，挑取結(jié)合子轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL安普霉素的BTN平板(可適當加入萘啶酮酸以防有大腸桿菌污染)。5～8 d后，提取基因組做菌落PCR：挑取結(jié)合子孢子至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)18～20 h，取4 mL種子液，離心去上清，按照TaKaRa提基因組試劑盒提取基因組，以pIB139通用引物(表2)做PCR驗證：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火15 s，退火溫度52 ℃(pls擴增時溫度為72 ℃)，72 ℃延伸2.06 min，循環(huán)次數(shù)為35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃維持。

1.2.4 分析方法

菌體干重(dry cell weight,DCW)測定：10 mL發(fā)酵液在5 000 r/min離心15 min，沉淀倒入干燥并稱重的濾紙上用去離子水洗滌2次后，105 ℃烘干至恒重，稱重并計算菌體量。上清液用于ε-PL等含量的測定。

ε-PL濃度測定：使用甲基橙法，具體參考ITZHAKI[19]測定方法。

葡萄糖濃度測定：使用生物傳感分析儀。樣品稀釋100倍，25 μL進樣量進行測定，生物傳感分析儀示數(shù)即為發(fā)酵液中葡萄糖濃度。

1.2.5 qRT-PCR

首先按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(B511321)操作步驟提取RNA，核酸電泳檢查RNA提取質(zhì)量，每個樣品做3次重復。其次，按照800 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體反應條件按照WANG等[20]方法進行，將得到的cDNA于-20 ℃保存。最后，將cDNA樣品稀釋10倍作為PCR反應模板進行PCR反應：2× SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，引物FPpls-qTF(10 μmol/L) 0.4 μL，引物Ppls-qTR (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA 2 μL，用ddH2O補足體系至20 μL。PCR條件按照WANG等[21]方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 pls基因克隆與過表達菌株構(gòu)建

以S.albulusM-Z18基因組為模板，以引物pls-F/R進行PCR擴增，得到大小為4 069 bp的pls基因，如圖1-a所示。將擴增得到的線性DNA片段pls回收純化后與線性化pIB139(經(jīng)NdeI和EcoR I酶切)進行一步克隆組裝，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coilDH5α進行質(zhì)粒擴增。提取得到的質(zhì)粒雙酶切(圖1b)和測序驗證后，獲得正確重組質(zhì)粒pIB139-pls。最后，將質(zhì)粒pIB139-pls轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coilET12567，并與預萌發(fā)的S.albulusM-Z18孢子混合涂布于MS平板進行接合轉(zhuǎn)移?；旌吓囵B(yǎng)18 h后，分別覆蓋終質(zhì)量濃度50 mg/L的安普霉素和25 mg/L的萘啶酮酸，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。將長出的結(jié)合子在含50 μg/mL安普霉素的BTN平板上進行松弛培養(yǎng)2代，再以pIB139通用引物M13(47)-F和M13(48-R)(表2)對松弛培養(yǎng)后的菌落進行菌落PCR驗證，得到理論大小正確的條帶(圖1-c)，獲得重組過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls。

a-pls基因的PCR擴增電泳圖;b-重組質(zhì)粒雙酶切鑒定;c-結(jié)合子菌落PCR鑒定結(jié)果圖1 pls分子驗證電泳圖Fig.1 Electropherogram of pls verification

2.2 過表達pls基因?qū). albulus發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響

將原始菌株S.albulusM-Z18、含空載質(zhì)粒菌株S.albulusM-Z18/pIB139和過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls進行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果顯示，S.albulusM-Z18/pIB139的ε-PL產(chǎn)量為(1.50±0.30) g/L與原始菌株S.albulusM-Z18產(chǎn)量(1.4～1.6 g/L)沒有明顯區(qū)別，而S.albulusM-Z18/pIB139-pls的ε-PL產(chǎn)量為(2.74±0.23) g/L，相較S.albulusM-Z18/pIB139和S.albulusM-Z18均提升了82.7%。進一步qRT-PCR檢測顯示，過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls中的pls基因轉(zhuǎn)錄水平較原始菌株S.albulusM-Z18上調(diào)了16.8倍，說明過表達pls基因能顯著提高ε-PL產(chǎn)量。

由于搖瓶發(fā)酵不能對pH值、溶氧、碳源濃度等發(fā)酵條件進行有效控制，因此，將實驗環(huán)境改為5 L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示。S.albulusM-Z18/pIB139和S.albulusM-Z18/pIB139-pls保持相同的菌體生長趨勢，均在96 h進入平穩(wěn)期，并在132 h進入衰亡期。同樣，ε-PL產(chǎn)量也保持相同的增長趨勢。發(fā)酵144 h后，S.albulusM-Z18/pIB139和S.albulusM-Z18/pIB139-pls的ε-PL產(chǎn)量分別達到37.57 g/L和40.62 g/L，菌體量分別為47.66 g/L和51.24 g/L。S.albulusM-Z18/pIB139-pls的菌體干重和ε-PL產(chǎn)量較S.albulusM-Z18/pIB139分別提高了26.1%和26.9%，表明S.albulusM-Z18/pIB139-pls的ε-PL產(chǎn)量增加可能是由菌體量的增加引起的。與上述搖瓶發(fā)酵結(jié)果相比，S.albulusM-Z18/pIB139-pls的ε-PL產(chǎn)量并未因為pls基因轉(zhuǎn)錄水平提高而增加。

圖2 S. albulus M-Z18/pIB139和S. albulusM-Z18/pIB139-pls在5 L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL結(jié)果Fig.2 Time profiles of S. albulus M-Z18/pIB139 and S. albulus M-Z18/pIB139-pls for ε-PL production in 5 L bio-fermenter by fed-batch fermentation

2.3 外源添加L-賴氨酸和ATP對過表達菌株S. albulus M-Z18/pIB139-pls合成ε-PL的影響

由2.2實驗結(jié)果可知，pls過表達之后的S.albulusM-Z18盡管其基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)了16.8倍，而在發(fā)酵過程中的產(chǎn)量卻只有微小的提升，對此我們進行了幾方面的猜想：pls基因轉(zhuǎn)錄大幅上調(diào)，而基因翻譯過程可能收到某些因素的影響沒有起到相應的效果；由于Pls是膜蛋白，需要結(jié)合到細胞膜表面才能進行正常的工作，那么細胞膜上是否有充足的裝配位點？恒定條件下細胞合成ε-PL的胞內(nèi)物質(zhì)是一個穩(wěn)定的代謝水平，其胞內(nèi)合成的前體物質(zhì)L-賴氨酸是否有足夠的通量供其合成產(chǎn)物？我們通過考察第3個條件來初步判斷出現(xiàn)這種情況的可能原因。

由表3可知，外源添加L-賴氨酸均能夠提高空載菌和pls過表達菌的搖瓶產(chǎn)量。隨著L-賴氨酸濃度的增加(1.0～7.0 g/L)，2株菌的ε-PL產(chǎn)量同步增加，并同時在5.0 g/LL-賴氨酸添加濃度時，實現(xiàn)最大ε-PL產(chǎn)量，分別達到(2.41±0.28) g/L和(3.35±0.08) g/L，較未添加分別提高了60.7%和22.2%。CHEN等[22]報道，外源添加2 g/LL-賴氨酸能夠提高S.albulusM-Z18搖瓶ε-PL產(chǎn)量5.2%，可知過表達pls能提高L-賴氨酸利用率和ε-PL產(chǎn)率。然而，外源添加ATP對S.albulusM-Z18/pIB139和S.albulusM-Z18/pIB139-pls搖瓶ε-PL產(chǎn)量的作用表現(xiàn)出顯著差異。添加ATP(1.0～4.0 mmol/L)能夠顯著提高S.albulusM-Z18/pIB139的ε-PL產(chǎn)量，但隨著ATP濃度增加，ε-PL產(chǎn)量提高幅度呈現(xiàn)下降趨勢；添加1.0 mmol/L ATP能夠?qū).albulusM-Z18/pIB139-pls搖瓶ε-PL產(chǎn)量提高18.2%，當添加量超過1.0 mmol/L后，ε-PL產(chǎn)量卻顯著下降并且低于對照值，這表明相對高濃度的ATP對ε-PL的合成表現(xiàn)出一定的反饋抑制，我們推測是高濃度的ATP影響了糖酵解和氧化磷酸化進程，進而影響了菌體整體活力。當我們在最適L-賴氨酸添加量(5.0 g/L)基礎上，繼續(xù)考察添加ATP(1.0～4.0 mmol/L)對提高ε-PL產(chǎn)量的作用，發(fā)現(xiàn)復合添加L-賴氨酸和ATP對2株菌的ε-PL產(chǎn)量影響如同單獨添加ATP，并在5.0 g/LL-賴氨酸+1.0 mmol/L ATP添加策略下，實現(xiàn)S.albulusM-Z18/pIB139-pls搖瓶ε-PL產(chǎn)量達到(3.99±0.72) g/L，較對照提高了45.6%，說明復合添加L-賴氨酸和ATP能夠最大化發(fā)揮ε-PL合成酶的作用。

表3 外源添加L-賴氨酸和ATP對pls過表達菌株合成ε-PL的影響Table 3 Effects of exogenous addition of ATP and lysine on ε-PL production by pls overexpressed strain

2.4 基于L-賴氨酸+ATP復合流加的過表達菌株S. albulus M-Z18/pIB139-pls發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL

為了更準確評估外源添加L-賴氨酸和ATP對過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響，我們將發(fā)酵過程放大到5 L發(fā)酵罐，發(fā)酵過程參數(shù)如圖3所示。S.albulusM-Z18-pIB139和S.albulusM-Z18/pIB139-pls在分別流加5.0 g/LL-賴氨酸+1.0 mmol/L ATP后，菌體生長趨勢和ε-PL產(chǎn)量增加趨勢保持一致，并分別在120 h達到最大菌體量(42.43和52.40 g/L)以及在144 h達到最高ε-PL產(chǎn)量(39.22和45.09 g/L)。由此可以看出，過表達pls基因不僅能夠提高ε-PL產(chǎn)量(增加15.0%)而且能夠提高菌體量(增加23.5%)。與未流加5.0 g/LL-賴氨酸+濃度1.0 mmol/L ATP的發(fā)酵結(jié)果(圖2)相比，復合流加L-賴氨酸和ATP將S.albulusM-Z18-pIB139的ε-PL產(chǎn)量提高了4.4%而菌體量降低了11.0%；將S.albulusM-Z18/pIB139-pls的ε-PL產(chǎn)量和菌體量提高了11.0%和2.3%，表明流加L-賴氨酸和ATP對對照菌株的ε-PL產(chǎn)量提升幾乎沒有貢獻，反而會降低菌體量；而對過表達pls基因的工程菌的ε-PL產(chǎn)量和菌體量均有提升作用。綜合來看，通過過表達pls基因和流加5.0 g/LL-賴氨酸+1.0 mmol/L ATP，可以將ε-PL產(chǎn)量從35.57 g/L提高到45.09 g/L，增加了20.8%；并將菌體量從47.66 g/L提高到52.40 g/L，增加了9.9%。從以上結(jié)果看，外源添加L-賴氨酸和ATP能部分提高pls過表達菌株的ε-PL產(chǎn)量，而對空載菌沒有明顯作用，這在一定程度上驗證了由于前體物質(zhì)缺乏導致pls過表達菌株產(chǎn)量提高不明顯的猜想，而提高的程度沒有達到轉(zhuǎn)錄水平的16.8倍，同樣可以證明猜想1和2的可能性，這部分還需要進一步的實驗證明。

在發(fā)酵過程中，空載菌和pls過表達菌株出現(xiàn)異于原始菌株的過程菌體量顯著上升又逐漸下降的情況。過程菌體量上升可能是由于包含強啟動子PermE*的pIB-139質(zhì)粒整合到S.albulusM-Z18基因組上多個attB位點時造成了某些代謝通量的增強，XU等[15]使用pSET152(pIB139同源質(zhì)粒)在S.albulusPD-1中過表達amtB基因時，空載菌和amtB過表達菌株發(fā)酵過程菌體量都出現(xiàn)一定程度的提高。有趣的是，2株工程菌在發(fā)酵120 h后菌體量又迅速下跌，可能的原因是此時發(fā)酵已進入衰亡期，大量的菌體老化，同時在50 mg/L安普霉素作用下迅速凋亡，新生菌體生成速度小于菌體老化死亡速度，造成菌體總量的下降。

3 結(jié)論

ε-PL在包括食品、化妝品和生物醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景，通過分子生物學手段改造生產(chǎn)菌，以進一步提高其發(fā)酵產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。本研究通過過表達ε-PL合成酶基因pls構(gòu)建過表達菌株S.albulusM-Z18/pIB139-pls，實現(xiàn)pls基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)16.8倍，搖瓶ε-PL產(chǎn)量達到(2.74±0.23) g/L，在5 L發(fā)酵罐中實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到40.62 g/L(144 h)。為進一步提高過表達菌株的生產(chǎn)能力，通過優(yōu)化L-賴氨酸和ATP外源添加濃度，最終建立S.albulusM-Z18/pIB139-pls在5 L發(fā)酵罐中同時流加5.0 g/LL-賴氨酸和1.0 mmol/L ATP的補料分批發(fā)酵方式，實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到45.09 g/L(144 h)，較對照菌株S.albulusM-Z18/pIB139提高了20.8%。可見，采用過表達pls基因并結(jié)合補充前體L-賴氨酸和能量輔因子ATP是一種有效提高ε-PL發(fā)酵水平的策略。