超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中16種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量

占繡萍，陳建波，馬 琳，陳 秀，黃蘭淇，劉 彬

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(上海)，上海 201103；2. 上海市青浦區(qū)蔬菜技術(shù)推廣站，上海 201200)

植物生長調(diào)節(jié)劑(plant growth regulator，PGRS)是人工合成的對植物的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化學(xué)物質(zhì)，具有和植物內(nèi)源激素具有相似生理功效和相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成物。植物生長調(diào)節(jié)劑能夠有效的掌控植物的生長和加強(qiáng)其抗逆性，有效的解決了許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的技術(shù)問題，展現(xiàn)出了高效的調(diào)控能力和廣闊的應(yīng)用前景。植物生長調(diào)節(jié)劑也是屬于農(nóng)藥的一種，雖然大部分毒性較低，但是長期食用含有PGRS的食品，會(huì)對人體健康造成潛在的健康危害[1-5]。我國在新版GB 2763-2019《食品中安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量中》[6]，已經(jīng)制定了19種植物生長調(diào)節(jié)劑在某些農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，可見安全使用植物生長調(diào)節(jié)劑越來越多的得到了政府的重視和人們的關(guān)注。

目前，國內(nèi)外關(guān)于植物生長調(diào)劑的檢測方法主要采用酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-19]。其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以其高靈敏度和高選擇性，被更多的應(yīng)用。樣品前處理方法中，分散固相萃取技術(shù)自2003年提出以來，在水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥多殘留檢測中得到廣泛應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)是前處理簡單方便，不僅化學(xué)試劑用量少，還能有效去除色素、果糖、脂肪等物質(zhì)的干擾，不易造成待測成分損失。本研究采用緩沖鹽/分散固相萃取和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，兼具簡單、快速、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合葡萄中植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留的定性定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置 Agilent1290 UPLC-Agilent6460超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配ESI源，T25DS25高速勻漿分散器；GB11240-89電熱恒溫水浴鍋；AC-40氮吹濃縮器；國華SHAC恒溫振蕩器；TDL-5-A離心機(jī)；Milli Q超純水系統(tǒng)；漩渦混合器(SCI LoGex MX-S)。

1.2 試劑乙腈和甲醇 (色譜純，德國Merck)，甲酸(色譜純，美國Fluka)，乙酸銨(色譜純，美國TEDIA)，高純水，氯化鈉(分析純)；十八烷基鍵和硅膠(C18)吸附劑：43～60μm，N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑：40～60μm，無水MgSO4， 凈化管(含100 mg PSA+300 mg MgSO4)。16種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品： 矮壯素、甲哌啶、抑芽丹、N6-腺嘌呤、赤霉酸、芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、脫落酸、噻苯隆、對氯吡氧乙酸、氯吡脲、蕓苔素內(nèi)酯、多效唑、2，4-D、烯效唑、戊唑醇(純度均>96%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配制成100mg/L的儲(chǔ)備液并儲(chǔ)存在-4℃冰箱中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取 準(zhǔn)確稱取粉碎并混勻后的葡萄樣品10g (精確至0.01g)，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入20mL5%乙酸的乙腈溶液，高速勻漿提取1min，加入4g硫酸鎂、1g檸檬酸鈉、0.5g檸檬酸氫二鈉、1顆玻璃均質(zhì)子，渦旋1min，4 000r/min離心5min，靜置60min，待乙腈相和水相分層。

1.3.2 凈化 葡萄樣品凈化：取4mL上層乙腈相溶液置于QuEChERS離心管(含100mg PSA+300mg MgSO4)，渦旋混合1min，以4 000r/min 離心5min，移取上清液，過0．22μm有機(jī)濾膜后，待測。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱： Agielnt Poroshell 120 EC-C18柱( 3.0mm×100mm，2.7μm) ； 以0.1%甲酸+5mmoL乙酸銨水溶液( A 相) 和甲醇(B 相) 為流動(dòng)相進(jìn)行線性梯度洗脫； 梯度洗脫程序： 0～1.0min，A 相的比例保持90%，1.0～2.5min，A 相的比例由90%降到70%，2.5～4.5min，A 相的比例由50%降到5%，4.5～7.0min，A 相的比例由5%降到1%，7.0～8.0min，A 相的比例保持1%%； 流速為0.35mL/min； 進(jìn)樣量： 2 μL； 柱溫： 40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用AJS ESI源，分段多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測(其中第1段：0～2.30min，正離子掃描，不加EMV電壓；第2段：2.3～4.8min，正離子掃描EMV加400v；第3段：4.8～5.4min，負(fù)離子離子掃描EMV加400v； 第4段：5.4～8.0min，正負(fù)離子同時(shí)掃描，負(fù)離子EMV加400v，正離子不加EMV)。霧化氣壓力：310.3kPa(40psi)；干燥氣溫度與流速：300℃，7L/min；鞘氣溫度與流速：350℃，12L/min；毛細(xì)管電壓：正離子3 000v，負(fù)離子3 500V。16種農(nóng)藥的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)(表1)。

表1 16種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)

續(xù)表

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化 本試驗(yàn)采取正負(fù)切換離子模式采集，選擇流動(dòng)相時(shí)，不僅需要關(guān)注正離子電離化合物的相應(yīng)，更重要的是負(fù)離子電離化合物在流動(dòng)相影響下的峰形和相應(yīng)靈敏度情況。試驗(yàn)選擇了有機(jī)溶劑甲醇、乙腈作為強(qiáng)洗脫相；水、含0.1%甲酸溶液、含5mmol/L 甲酸銨、含5mmol/L乙酸銨溶液作為弱洗脫相，對其不同搭配進(jìn)行了比較。

首先以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相來分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈-水洗脫的時(shí)候，副模式下電離的化合物如赤霉酸、脫落酸、對氯吡氧乙酸及2，4-D靈敏度很低，幾乎不出峰；且正模式電離的化合物如芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、氯吡脲、噻苯隆、N6-異戊烯基腺嘌呤等5種靈敏度偏低的化合物，響應(yīng)也明顯偏低；其他靈敏度好的化合物，雖然用乙腈電離被增強(qiáng)，但是已經(jīng)超出了檢測必需的必要度。所以本試驗(yàn)選擇甲醇作為強(qiáng)洗脫相。對比甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸-5 mmoL/L甲酸銨溶液和乙腈-0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲醇- 0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液對于靈敏度偏低的化合物電離效果最好，響應(yīng)高，對副模式采集的峰形和響應(yīng)都較好。因此選擇甲醇和0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 使用單針自動(dòng)進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化16種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件?；衔镞M(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H+離子或[M-H]-離子。其中對氯吡氧乙酸、2，4-D、脫落酸、赤霉酸，形成穩(wěn)定的[M-H]-離子，其他農(nóng)藥均選擇了[M+H]+離子。確定了化合物母離子后，在SIM 模式下，對化合物的Fragment(碎裂電壓)進(jìn)行優(yōu)化；母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片。在Product Ion模式下，對化合物母離子施加一定量的碰撞能量(CE)，得到其相應(yīng)的離子碎片；最后在MRM 模式下，優(yōu)化目標(biāo)物離子碎片的最佳碰撞能量。對于正負(fù)離子同時(shí)采集時(shí)，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子靈敏度偏低，根據(jù)化合物靈敏度高低不同，故EMV(電子倍增管電壓)負(fù)離子掃描時(shí)分別加-200、-400 V，而正離子采集的化合物中，僅抑芽丹靈敏度較低，所以分段采集并給它加+200V，從而提高檢測靈敏度。并同時(shí)優(yōu)化了質(zhì)譜毛細(xì)管電壓、碎裂電壓、碰撞能量、電子倍增管電壓等質(zhì)譜條件。16種農(nóng)藥和空白葡萄的MRM 色譜圖(圖1、圖2)。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑優(yōu)化 查詢文獻(xiàn)，大多數(shù)植調(diào)劑在酸性條件下提取，穩(wěn)定性明顯高于中性條件的提取。因此本研究采取乙腈加不同濃度的乙酸作為提取劑，來比較回收率情況。以0.1%、1%、2%、5%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑，平行操作3次，考察4種提取溶劑在同一種凈化包(100mg C18、100mg PSA 、300mg MgSO4混合)處理效果(圖3) 。當(dāng)提取溶劑為5%乙酸乙腈時(shí)，除了矮壯素、甲哌啶外，其他植調(diào)劑平均回收率70.4%～109.7%，而且明顯優(yōu)于其他三種提取劑。這可能是由于酸性條件抑制了植物生長調(diào)節(jié)劑中羧基的電離，從而增加了其在乙腈中的溶解度。

2.3.2 凈化條件優(yōu)化 QuEChERS方法作為一種新型的前處理方法，較普通的SPE方法具有明顯的優(yōu)勢；用QuEChERS方法溶劑使用量相對較少，無需淋洗，操作簡單，所需時(shí)間少，所需凈化劑的材料價(jià)格相對低廉。如N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(Carb)是常用的吸附劑材料。PSA吸附劑可有效去除樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖等干擾物；C18吸附劑對極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇類、色素等大分子基質(zhì)干擾物有較好的吸附效果；Carb吸附劑對去除葉綠素類胡蘿卜素等色素以及固醇類雜質(zhì)有很好的效果。

試驗(yàn)選擇葡萄樣品進(jìn)行研究，C18和PSA均能不同程度的去除花色苷，但是比較提取溶劑優(yōu)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：去除雜質(zhì)的同時(shí)，矮壯素、甲哌啶也可能同時(shí)被吸附了，所以不再考慮Carb，因此采用100 mg C18+100 mg PSA+300 mg MgSO4、100 mg C18+300 mg MgSO4、100 mg PSA+300 mg MgSO43種凈化劑一定比例的組合，所得的回收率結(jié)果(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于矮壯素、甲哌啶、抑芽丹等幾種極易被吸附的植調(diào)劑，發(fā)現(xiàn)用PSA凈化的回收率能滿足要求，優(yōu)于其他組的搭配的凈化劑。在這種方法下，16種植調(diào)劑的平均回收率在71.5%～99.3%，滿足殘留檢測要求。

2.4 線性范圍和檢出限 在優(yōu)化的條件下進(jìn)行了方法學(xué)的考察。用甲醇配制16種植調(diào)劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L，進(jìn)樣2μL，以MRM定量離子的色譜峰面積(Y)對分析物質(zhì)量濃度(X， mg/L)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.986 6～0.999 7之間，表明各化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)，得到16種農(nóng)藥的LOD為0.03～1.0 μg/kg。列出了16種植調(diào)劑的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(表2)。按照保留時(shí)間先后分別列出16種植調(diào)劑各自的色譜圖和質(zhì)譜圖(圖5)。

表2 16種植調(diào)劑的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.5 回收率、精密度和定量限 選用不含目標(biāo)化合物的兩種葡萄空白樣品陽光玫瑰(綠皮葡萄)和巨玫瑰(紫皮葡萄)，通過添加回收試驗(yàn)，考察了方法的回收率和精密度(n=5)。16種植調(diào)劑的添加濃度水平為0.05、0.10、0.50mg/kg，結(jié)果表明，16種植調(diào)劑的平均加標(biāo)回收率范圍為71%～114.5%，RSD在0.9%～17.8%之間，方法的回收率和精密度均符合殘留分析要求。

表3 陽光玫瑰和巨玫瑰葡萄中16種植調(diào)劑的回收率、精密度和定量限

續(xù)表

3 小結(jié)

本文通過對提取溶劑、凈化劑和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定葡萄中16種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的方法。該方法簡便快捷、靈敏可靠，線性、準(zhǔn)確度和精密度較好，同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測速度，為葡萄中16種植調(diào)劑的多殘留檢測、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。