丹參酮ⅡA對長春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠痛覺過敏的影響及其機制

付寶軍，姜靜靜，黃玉瓊，林宗航，李 恒

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 清遠(yuǎn) 511518)

長春生物堿類(長春新堿)、杉類(紫杉醇)、鉑類(順鉑)等是目前臨床常用的抗腫瘤藥物，在臨床治療中發(fā)揮重要作用。然而，這些藥物在抗腫瘤的同時會產(chǎn)生神經(jīng)損傷毒性作用，誘發(fā)痛覺過敏和超敏反應(yīng)，稱化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain, CINP)簡稱化療痛。目前，該疼痛對常規(guī)的鎮(zhèn)痛藥(包括阿片類鎮(zhèn)痛藥和非甾體抗炎鎮(zhèn)藥)不敏感，給病人帶來極大的痛苦，制約了腫瘤的加量化療，降低腫瘤的治愈率。因此，開發(fā)和尋找針對機制治療化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛新藥物具用重大意義。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的脂溶性成分之一，是近年來對中藥單體中研究較多、且有明確分子結(jié)構(gòu)的有效活性成分。我們最近研究發(fā)現(xiàn)Tanshinone ⅡA在長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型中顯示明顯抗傷害效應(yīng)[1]，但其作用機制仍不清楚。c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族有三個主要成員之一，通過改變轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)靶蛋白的翻譯后修飾，將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。一些證據(jù)表明，MAPK通路活化在痛覺信息調(diào)制中發(fā)揮重要作用，尤其是脊髓中JNK激活促發(fā)腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin- 6, IL-6)和白介素-1β ( interleukin-1β IL-1β )的產(chǎn)生[2]，使背角神經(jīng)元敏感化，促進(jìn)慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展，因此提示抑制脊髓JNK激活將有助于抑制慢性疼痛敏感化。作為具有抗炎、抗氧化作用Tanshinone ⅡA是否通過作用JNK信號通路，抑制炎性因子發(fā)揮作用，目前報道甚少。本研究建立長春新堿誘導(dǎo)化療痛模型，在細(xì)胞和分子水平探討星形膠質(zhì)細(xì)胞p-JNK及其炎癥反應(yīng)在Tanshinone ⅡA緩解長春新堿誘導(dǎo)NP可能作用機制，為丹參酮ⅡA用于臨床治療CINP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和藥品：Tanshinone ⅡA注射液(生產(chǎn)批號：20180406，江西國藥有限公司，中國)，兔抗大鼠JNK單克隆抗體 、GFAP單克隆抗體、兔抗大鼠離子鈣結(jié)合適配器分子1(ionized calcium binding adapter molecule1，Iba1)單克隆抗體(Abcam公司，美國)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，Trizol RNA 抽提試劑、BeyoR TTM cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ELASA試劑盒(生產(chǎn)批號：69-76215，武漢博士德生物科技有限公司), PCR引物(北京天根生化科技有限公司合成)。熱痛刺激儀、von Frey細(xì)絲(Stoelting公司，美國)。

1.2實驗動物：健康雄性SD大鼠(200～230g)由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許SYXK(粵)2019-0206]。所有實驗操作程序均經(jīng)清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實驗動物福利與應(yīng)用委員會批準(zhǔn)，遵守國際衛(wèi)生學(xué)會《實驗動物福利和應(yīng)用指南》。

1.3模型建立及分組：整個實驗過程中動物自由攝食和飲水,室溫(22±1)℃，光照周期12h(7∶00～19∶00光照;19∶00～7∶00黑暗)。SD大鼠40只，按隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組、CINP組、CINP+NS組和CINP+Tan組，每組10只。CINP組：建立CINP模型，方法為隔日腹腔注射長春新堿125μg/kg,共計4次，第1次注射當(dāng)天視為第1天。CINP+NS組和CINP+Tan組：建立CINP模型后于第8天開始連續(xù)7d 每天1次腹腔注射生理鹽水10uL或丹參酮ⅡA(20mg/kg)。

1.4MWT的測定：用von Frey纖維絲up-down法推算機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)：將一有機玻璃箱(22cm×22cm×22cm)置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠在有機玻璃箱中適應(yīng)15min后，采用ⅡTC2390系列電子von Frey垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤4s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，每次刺激間隔10s重復(fù)5次。給藥前和給藥后1、3、5、7、9、11、14d分別采用MWT評價大鼠痛覺過敏。

1.5TWL的測定：用熱輻射法測定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)：將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上， 用熱痛刺激儀照射大鼠足底，照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為TWL。自動切斷時間為25 s，以防止組織損傷。測定5次，每次間隔3 min，取平均值為大鼠TWL值。給藥前和給藥后1、3、5、7、9、11、14d分別采用TWL評價大鼠痛覺過敏。

1.6Western Blot檢測p-JNK、GFAP、Iba1表達(dá)： 第14天，每組各取3只大鼠大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后斷頭處死，冰上取出脊髓腰膨大部位，加入裂解液進(jìn)行勻漿， 4℃下12000 rpm離心5 min，并進(jìn)行BCA蛋白定量后每份樣品使用20 μg蛋白質(zhì)。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80伏恒壓，分離膠電泳條件為100伏恒壓，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2h,加入β-actin(兔抗小鼠，1∶2000),p-JNK，GFAP、Iba1一抗，4℃孵育過夜后TBST洗膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3000)室溫孵育2h后TBST洗膜4次，每次10min。ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影，采用Image J軟件檢測目的蛋白條帶及β-actin蛋白條帶的灰度值，目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.7免疫熒光化學(xué)檢測脊髓p-JNK和GFAP蛋白:第14天，各組大鼠取3只經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定，取大鼠腰4～6脊髓節(jié)段，4%多聚甲醛后固定2h，依次于20%、30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片。免疫熒光染色：磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS) (0.01 moL/L，pH值7.4)洗片3次，20 min/次；加5%羊血清室溫封閉2 h；加p-JNK、GFAP一抗，4℃過夜孵育；次日復(fù)溫至室溫后PBS洗3次，15 min/次；分別加入Cy3標(biāo)記和FITC熒光二抗(1：1 000)，室溫孵育2 h，PSB洗3次，20 min/次，晾干，封片；切片在共聚焦激光掃描顯微鏡(FV-1000，Olympus，Tokyo，Japan)下觀察，獲得圖像。

1.8RT-PCR測定脊髓TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA:第14天，每組各取3只大鼠安樂死后進(jìn)行檢查。 TRIzol reagent(Invitrogen，美國)提取大鼠L4～6脊髓總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用ΔΔCT 法來測定目的基因mRNA含量。引物由上海生物工程公司合成為：TNF-α上游引物：5'-CACCACGCTCTTCTGTCT-3'；下游引物5'-GGGCTTGTCACTCGAGTT-3'，IL-6上游引物：5'-CTGCTCTGGTCTTCTGGAGT-3'；下游引物5'-GCATTGGA AGTTGGGGTAGG-3'， IL-1β 上游引物：5'-TGCACTGCAGGCTTCGAGAT-3'；下游引物5'- CCAAGGCCACAGG GATTTTG-3'。β - actin上游引物：5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3'；下游引物：5'-TAGGAGCCAGGGC AGTAATCT-3'。擴增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，54℃30s，72℃ 20s，共45個循環(huán)，72℃延伸10min。計算目的基因與內(nèi)參照β-actin的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.9ELISA檢測脊髓TNF-α、IL-6、IL-1β含量變化:L4～L6脊髓節(jié)段勻漿后于4℃，3500r/min下離心10min(離心半徑為5cm)，提取上清液并在-80℃保存。按ELISA測定試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。采用NK3酶標(biāo)儀于波長490nm處測定光密度值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠MWT和TWL的變化 與Control組比較，CINP組大鼠在給藥后3d到本實驗觀察結(jié)束MWT [3d：(11.8±0.8)g；5d：(9.3±0.8)g；7d：(7.7±1.0)g；9d：(8.7±0.7)g；11d：(8.3±1.0)g；14d：(7.7±0.6)g]和TWL [3d：(12.2±0.8)s；5d：(9.3±0.8)s；7d：(8.2±1.1)s；9d：(8.8±0.8)s；11d：(8.6±1.1)s；14d：(8.3±1.1)s]明顯降低(P<0.01)；與CINP+NS組相比，CINP+Tan組大鼠在給藥后9、11、14d MWT[9d：(10.6±0.5)g；11d：(10.8±0.7)g；14d：(10.6±0.9)g]和TWL[9d：(11.0±1.0)s；11d：(11.2±1.3)s；14d：(10.8±0.8)s]明顯增加(P<0.01)(見圖1)。各腹腔給藥組對大鼠運動功能均無影響。

圖1 各組大鼠TWL和MWT變化

2.2各組大鼠脊髓p-JNK、GFAP、Iba1蛋白表達(dá):與Control組比較，CINP組大鼠脊髓背角p-JNK(1.70±0.10)、GFAP(1.71±0.12)表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CINP+NS組相比，CINP+Tan組大鼠脊髓背角p-JNK(1.25±0.20)、GFAP(1.24±0.16)表達(dá)明顯降低(P<0.05)；各組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

圖2 各組大鼠脊髓p-JNK、GFAP、Iba1蛋白表達(dá)

2.3各組大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)：與Control組比較，CINP組大鼠脊髓背角TNF-α(250±31)pg/mg、IL-6(220±25)pg/mg、IL-1β(170±36)pg/mg蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CINP+NS組相比，CINP+Tan組大鼠脊髓背角TNF-α(150±20)pg/mg、IL-6(120±22)pg/mg、IL-1β(123±28)pg/mg蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)

2.4各組大鼠脊髓背角炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β miR 表達(dá)的變化：與Control組比較，CINP組大鼠脊髓背角TNF-α(1.70±0.14)、IL-6(1.73±0.12)、IL-1β(1.72±0.15)miR 表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與CINP+NS組相比，CINP+Tan組大鼠脊髓背角TNF-α(1.32±0.11)、IL-6(1.33±0.10)、IL-1β(1.68±0.13)miR表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β miRNA表達(dá)

2.5CINP大鼠脊髓背角JNK與GFAP共定位表達(dá)，見圖5。

圖5 CINP大鼠脊髓背角磷酸化JNK與GFAP共定位表達(dá)

3 討 論

本研究制備的長春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，該模型的優(yōu)點是操作簡單，穩(wěn)定性好，與臨床CINP特征有相似之處。研究結(jié)果表明，CINP大鼠從長春新堿注射后3d MWT和TWL開始明顯降低，7d穩(wěn)定并持續(xù)維持到本實驗觀察結(jié)束，表明CINP模型成功建立；相反丹參酮ⅡA腹腔注射大鼠MWT和TWL明顯升高。丹參酮ⅡA因其抗氧化和抗炎作用已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、腫瘤等疾病治療，并且最近丹參酮ⅡA的抗傷害性作用已在糖尿病致神經(jīng)損傷疼痛模型中得到證實[3]；更重要是我們前期實驗證實，丹參酮ⅡA明顯抑制化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺過敏，并呈劑量依賴性，在前期研究使用3個不同劑量丹參酮ⅡA(10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg)腹腔注射CINP大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20mg/kg、50mg/kg劑量丹參酮ⅡA產(chǎn)生明顯抗傷害作用且均無毒副作用發(fā)生[4]。本實驗選擇20mg/kg丹參酮ⅡA腹腔注射，探討丹參酮ⅡA在CINP模型抗痛覺過敏作用機制。

已有研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞(主要分為小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞)，尤其星形膠質(zhì)細(xì)胞在化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛中扮演重要角色[5]。Wahlman等[6]研究表明，增強脊髓腺苷激酶水平通過星形膠質(zhì)細(xì)胞依賴機制促進(jìn)化療誘導(dǎo)的疼痛；相反，Hao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素抑制TRPV1上調(diào)和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化對奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病理性疼痛大鼠的產(chǎn)生保護(hù)作用。以上證據(jù)提示，抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能與藥物或激活內(nèi)源性激酶有效緩解化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛作用機制相關(guān)。我們結(jié)果表明，丹參酮ⅡA腹腔注射抑制痛覺過敏同時伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減少，但通過檢測另一類重要膠質(zhì)細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1表達(dá)顯示丹參酮ⅡA腹腔注射后小膠質(zhì)細(xì)胞活化未受影響，然而最近yan等[8]研究證實，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放白介素-1增強谷氨酸活性參與紫杉醇誘導(dǎo)痛覺過敏，與我們實驗結(jié)果差異或許源于動物模型、觀測時間點、動物種屬不同?？傊?，我們實驗結(jié)果提示，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化作為丹參酮ⅡA抑制化療藥物誘導(dǎo)痛覺過敏可能作用機制。普遍認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放炎性因子，炎性因子敏化脊髓感覺神經(jīng)元，導(dǎo)致中樞敏化。已有研究表明，炎性細(xì)胞因子在化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Mazidi等[9]研究表明，阻斷細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減輕紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛大鼠痛行為學(xué)；另有研究發(fā)現(xiàn)[10]，吳茱萸堿通過抑制炎癥和維持線粒體抗氧化功能來改善紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，以上提示抑制或阻斷脊髓水平炎性細(xì)胞因子可能有效緩解化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛，我們結(jié)果表明，丹參酮ⅡA腹腔注射抑制痛覺過敏同時伴有脊髓TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)明顯下調(diào)。提示丹參酮ⅡA緩解化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛與脊髓炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

c-Jun N-末端激酶(JNK)是MAPK家族有三個主要成員之一，其調(diào)控作用在內(nèi)臟炎性疼痛動物模型中已經(jīng)證實，但其在化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛中作用報道甚少。最近研究[11]表明，紫杉醇誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)病理性疼痛，可能通過脊髓背角ERK1/2和JNK通路下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)來實現(xiàn)的；與其報道相一致，我們研究表明，與CINP組比較，丹參酮ⅡA腹腔注射抑制痛覺過敏同時伴有脊髓p-JNK表達(dá)下調(diào)，同時免疫熒光共定位結(jié)果提示CINP組大鼠脊髓p-JNK與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP蛋白共定位，我們結(jié)果提示，腹腔注射丹參酮ⅡA通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK通路活化緩解化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛。盡管我們初步證實：星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK通路活化在丹參酮ⅡA緩解化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛作用機制中作用，但是本實驗無法確定星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK通路活化與脊髓TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)的因果關(guān)系，還有待實驗進(jìn)一步證實。

總之，在本實驗條件下腹腔注射丹參酮ⅡA明顯抑制長春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠痛覺過敏，其作用機制可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK通路活化及其炎癥反應(yīng)相關(guān)。