巖白菜素抑制AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的作用

張鴻晨 陳杰民 沈紅璋 楊建鋒 張?bào)泺P

近年來(lái)，炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病率在我國(guó)及其他亞洲國(guó)家呈逐年上升趨勢(shì)。我國(guó)IBD中潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的比例顯著高于克羅恩?。?］。炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌（CAC）是導(dǎo)致IBD患者死亡的主要原因之一［2］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中含量最多的免疫細(xì)胞，通過(guò)分泌大量炎性因子、生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及血管生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲［4］。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)TAM的干預(yù)治療能有效改善結(jié)直腸癌預(yù)后［5］。巖白菜素（Bergenin）是從巖白菜屬植物中提取的異香豆素類(lèi)化合物，既往發(fā)現(xiàn)巖白菜素具有一定的抗炎、抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制目前尚不清楚［6］。本研究通過(guò)對(duì)CAC模型小鼠預(yù)防性給予巖白菜素，探討巖白菜素對(duì)CAC的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性C57BL/6小鼠32只（6～8周齡，體質(zhì)量19～25g）采購(gòu)自維通利華公司［SCXK（浙）2019-0001］，在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境飼養(yǎng)1周，室溫22～24℃，相對(duì)濕度40%～55%，光照12h/d。自由飲水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2018年10月至2019年11月。

1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉（dextransodiumsulfate，DSS）分子量36000～50000，購(gòu)買(mǎi)自MP Biomedicals公司。巖白菜素（Bergenin，BG）購(gòu)買(mǎi)自南京景竹生物科技有限公司。氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich公司。Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自Lifetechnology公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Applied Biosystems公司。BrdU，CD8和CD68抗體均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam公司。HE染色液，即用型免疫組化染色試劑盒和二抗均購(gòu)買(mǎi)于上海碧云天科技有限公司。STAT3和pSTAT3抗體購(gòu)買(mǎi)自Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 Nanodrop 2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Applied Biosystems公司。光學(xué)顯微鏡（CX31型）購(gòu)買(mǎi)自日本Olympus公司。Western-blotting檢測(cè)顯色成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。LEICA DFC300 FX圖像采集系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)LEICA公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）模型建立：將小鼠隨機(jī)分為3組，即空白組、AOM/DSS組和巖白菜素+AOM/DSS組（BG+AOM/DSS）。CAC造模方法：給腹腔注射AOM（劑量10mg/kg）1周后開(kāi)始，給予小鼠自由飲用含2%DSS的純凈水1周，繼而飲用1周正常純凈飲用水，反復(fù)3個(gè)循環(huán)。巖白菜素給藥組小鼠從第1周至第13周，用巖白菜素50mg/（kg·d）灌胃，空白組和模型組每日灌服純凈水作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每3d記錄小鼠體質(zhì)量和死亡情況，13周結(jié)束后處死小鼠，打開(kāi)腹腔，從盲腸末端至肛門(mén)處取下整段結(jié)直腸。沿結(jié)腸端縱向剖開(kāi)腸管，記錄腫瘤數(shù)目和腫瘤大小和腫瘤負(fù)荷（每條結(jié)直腸中腫瘤直徑之和）。造模方法見(jiàn)圖1。（2）結(jié)腸成瘤判斷和病理檢查：計(jì)算結(jié)腸肉眼可見(jiàn)的成瘤數(shù)，實(shí)驗(yàn)中使用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤平均直徑，進(jìn)而計(jì)算腫瘤負(fù)荷（即所有腫瘤的直徑之和），記錄各組小鼠直徑≥2mm的腫瘤比例。結(jié)腸組織樣本用 10%甲醛固定后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，采用H&E染色，并在光鏡下觀察組織染色情況，結(jié)腸切片請(qǐng)病理科醫(yī)生判斷是否形成腫瘤和評(píng)估。（3）RT-qPCR檢測(cè)：將結(jié)腸組織放置在Trizol中研磨提取總RNA，然后使用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度與純度。使用Applied Biosystems反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒進(jìn)一步合成cDNA，進(jìn)而進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增（引物見(jiàn)表1）。設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃ 5min，（95℃ 15s，56℃15s，72℃ 5s）40個(gè)循環(huán)。選擇18S mRNA 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析目的基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。（4）Western blotting檢測(cè)：液氮冷凍后研磨結(jié)腸組織，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞。離心后收集上清液，采用BCA試劑盒定量總蛋白濃度。加樣，使用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇活化的PVDF膜上。然后使用5%脫脂牛奶浸泡PVDF膜室溫封閉，洗滌，再與特異性一抗（STAT3，pSTAT3，GAPDH抗體）室溫孵育4℃過(guò)夜，洗滌，然后將PVDF膜放入使用辣根過(guò)氧化物酶的二抗中室溫孵育1h。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑與PVDF 膜作用后進(jìn)行顯影和定影，檢測(cè)STAT3，pSTAT3，GAPDH蛋白表達(dá)量。（5）免疫組化和免疫熒光染色：首先將石蠟切片進(jìn)行二甲苯，酒精，蒸餾水梯度浸泡脫蠟后復(fù)水。使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液置于水浴槽中100℃水浴修復(fù)20min，置于室溫中進(jìn)行自然冷卻。去離子水清洗后浸泡于含有3%的H2O2溶液中置于4℃冰箱中10min封閉組織中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。使用5%的BSA溶液室溫封閉30min。使用一抗孵育4℃冰箱中過(guò)夜。復(fù)溫清洗后使用辣根過(guò)氧化物酶或熒光標(biāo)記的二抗置于室溫中孵育1h后清洗。免疫組化染色使用DAB顯色后，蘇木素染色后封片；免疫熒光染色使用DAPI然后封片。

圖1 動(dòng)物模型的造模和給藥方法

表1 RT-qPCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巖白菜素對(duì)CAC小鼠模型體重、死亡率和成瘤率影響 CAC小鼠模型體重與小鼠的病情發(fā)展程度相關(guān)，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠體重進(jìn)行記錄以監(jiān)測(cè)小鼠狀況及巖白菜素的療效。空白組小鼠體重逐漸上升，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。給予AOM/DSS的造模組小鼠，在給予DSS后開(kāi)始出現(xiàn)便軟、便血及脫肛等癥狀，逐漸出現(xiàn)毛發(fā)不順、精神萎靡不振等表現(xiàn)。而給予巖白菜素+AOM/DSS（BG+AOM/DSS）組小鼠，在給予DSS后體重下降減少。與AOM/DSS組比較，巖白菜素能夠明顯改善AOM/DSS造模對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（見(jiàn)圖2A）。對(duì)照組小鼠結(jié)直腸中未見(jiàn)異常增生組織；AOM/DSS組小鼠結(jié)直腸中可見(jiàn)大小不等的腫瘤，數(shù)量為（7.6±2.3），腫瘤負(fù)荷為（15±2.9）；巖白菜素治療組小鼠結(jié)直腸中存在少量增生和腫瘤，數(shù)量為（4.8±1.3），腫瘤負(fù)荷為（7.4±2.5），較AOM/DSS造模組顯著下降（P<0.01）（見(jiàn)圖2B、C）。比較結(jié)腸腫瘤大小組成比例發(fā)現(xiàn)，BG+AOM/DSS組小鼠直徑≥2mm的腫瘤比例顯著低于AOM/DSS組（P<0.001）（見(jiàn)圖2D）。給予AOM/DSS造模之后，結(jié)腸癌模型組小鼠在第4周開(kāi)始出現(xiàn)死亡，93d時(shí)整體死亡率為41.7%，給予巖白菜素組小鼠第9周才開(kāi)始出現(xiàn)死亡，93d時(shí)整體死亡率為8.3%，巖白菜素治療組能夠提高CAC模型小鼠的存活時(shí)間，改善生存率（見(jiàn)圖2E）。

圖2 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠結(jié)腸腫瘤的影響

2.2 巖白菜素對(duì)CAC小鼠模型組織病理學(xué)的影響 空白組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)果排列整齊，且結(jié)腸黏膜層及黏膜肌層結(jié)構(gòu)完整；AOM/DSS組小鼠黏膜層部分破壞，隱窩分支呈樹(shù)狀生長(zhǎng)，且背靠背腺體生成，腫瘤惡性程度較高，巖白菜素治療組病理表現(xiàn)明顯較模型組減輕，上皮細(xì)胞損傷較輕，黏膜層和肌層結(jié)構(gòu)完整。進(jìn)一步使用BrDU評(píng)估結(jié)腸上皮細(xì)胞異常增殖情況，與AOM/DSS組比較，巖白菜素治療能使腫瘤區(qū)域增殖細(xì)胞數(shù)量降低51.4%［（35.5±6.9） vs. （17.3±4.3），P<0.001］，而非腫瘤區(qū)域隱窩增殖細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差別（見(jiàn)圖3）。

圖3 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠結(jié)直腸組織病理與細(xì)胞增殖的影響

2.3 巖白菜素對(duì)CAC小鼠結(jié)腸炎癥因子和pSTAT3表達(dá)的影響 BG+AOM/DSS組小鼠結(jié)腸中促炎因子IL-6，IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)顯著低于AOM/DSS組（見(jiàn)表2）。在CAC炎癥腫瘤進(jìn)程中，多種炎性因子通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3參與促癌進(jìn)程。BG+AOM/DSS組結(jié)腸中pSTAT3表達(dá)量顯著降低（P<0.001）（見(jiàn)表3、圖 4）。

2.4 巖白菜素對(duì)CAC小鼠腫瘤微環(huán)境中TAM和CD8+T細(xì)胞的影響 BG+AOM/DSS組結(jié)腸腫瘤中TAM細(xì)胞數(shù)量較AOM/DSS組降低［（77.2±11.1） vs.（33.2±6.1），P<0.001］，具有抗腫瘤免疫功能的CD8+T細(xì)胞數(shù)量增多［（20.5±7.1） vs. （50.7±18），P<0.01］（見(jiàn)圖 5）。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6，IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)水平

表3 各組大鼠結(jié)腸組織STAT3和pSTAT3表達(dá)水平

圖4 AOM/DSS組與BG+AOM/DSS組小鼠結(jié)腸STAT3和pSTAT3蛋白表達(dá)的電泳圖

圖5 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠腫瘤微環(huán)境中TAM和CD8+T細(xì)胞的影響

3 討論

巖白菜素是從從巖白菜屬植物中提取的異香豆素類(lèi)化合物，臨床上目前應(yīng)用于治療慢性支氣管炎患者，既往發(fā)現(xiàn)巖白菜素具有一定的抗炎、抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制目前尚不清楚［6］。本研究顯示，巖白菜素能有效緩解AOM/DSS模型小鼠體重減低，減少小鼠結(jié)直腸內(nèi)腫瘤的發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞增殖，增加小鼠生存率。同時(shí)，巖白菜素能夠降低AOM/DSS模型小鼠腫瘤微環(huán)境中炎性促癌因子及pSTAT3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，增加CD8+T細(xì)胞比例，其機(jī)制可能與降低TAM浸潤(rùn)相關(guān)。

目前研究共識(shí)認(rèn)為慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及治療耐受作用［7］。CAC是導(dǎo)致IBD患者死亡的主要原因之一。與散發(fā)性結(jié)直腸癌不同，CAC的發(fā)病機(jī)制中更多依賴(lài)腫瘤微環(huán)境中的大量炎性因子和免疫細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素具有多種抗炎功能，并且通過(guò)激活PPAR-γ緩解結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，但尚無(wú)其對(duì)于炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌作用的研究［8］。AOM/DSS誘導(dǎo)CAC小鼠模型是目前最常用的腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型之一，其具有成瘤率高、周期短的優(yōu)點(diǎn)［9］。本研究使用AOM/DSS誘導(dǎo)CAC小鼠模型，在第13周留取小鼠組織，模型成瘤率100%。本研究顯示，與AOM/DSS組比較，巖白菜素治療組小鼠生存率明顯增高，結(jié)腸腫瘤數(shù)量和負(fù)荷明顯下降，提示巖白菜素在CAC中具有顯著的抑制腫瘤的作用。

當(dāng)下共識(shí)認(rèn)為，局部促炎微環(huán)境通過(guò)激活促癌基因在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。既往研究發(fā)現(xiàn)多種促炎因子包括IL-6，IL-17和IL-23的高表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［10］。以IL-6為主的多種促炎因子通過(guò)激活致癌轉(zhuǎn)錄因子STAT3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活。研究證實(shí)，阻斷IL-6-STAT3通路能夠有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括結(jié)直腸腫瘤、皮膚腫瘤等［11］。本研究結(jié)果顯示，巖白菜素治療能夠顯著降低結(jié)腸中IL-6，IL-17和IL-23等促炎因子mRNA表達(dá)，同時(shí)能夠抑制STAT3磷酸化，提示巖白菜素在CAC模型中可能通過(guò)拮抗IL-6-STAT3信號(hào)通路抑制腫瘤生長(zhǎng)。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存和發(fā)展的內(nèi)環(huán)境，近年來(lái)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞或因子的相互作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。其中，CD8+T細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中公認(rèn)的抗腫瘤免疫細(xì)胞，其能夠通過(guò)釋放γ-干擾素、穿孔素和顆粒酶B等腫瘤毒性細(xì)胞因子達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用［12］。本研究顯示，巖白菜素治療后CAC模型小鼠結(jié)腸中CD8+T細(xì)胞升高，表明巖白菜素的抗癌作用依賴(lài)其對(duì)于腫瘤微環(huán)境的影響。TAM是腫瘤微環(huán)境中含量最多的免疫細(xì)胞，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)血管生成起重要作用［13］。同時(shí)，TAM的浸潤(rùn)能夠降低抗腫瘤藥物敏感性。本研究顯示，巖白菜素能夠顯著降低CAC模型結(jié)腸腫瘤中的TAM細(xì)胞，對(duì)癌旁組織無(wú)顯著影響，提示巖白菜素可能通過(guò)抑制TAM調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤生長(zhǎng)。