液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素

李 艷，許舒欣，劉海培，張遠(yuǎn)清，胡 瑋，李小強(qiáng)，程文播*

(1.天津國(guó)科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，天津 300399； 2.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇蘇州 215163；3.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072)

嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(Pheochromocytoma and Paraganglioma，PPGL)是一種源于腎上腺髓質(zhì)或腎上腺外交感神經(jīng)鏈的腫瘤，主要合成并分泌兒茶酚胺，進(jìn)而引起高血壓等癥狀，并造成心、腦、腎等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]?；颊咭话阍缙跊](méi)有明顯癥狀，直到腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到身體的其他部位才被診斷出來(lái)，所以早期診斷對(duì)于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療和預(yù)后具有十分重要的意義。

兒茶酚胺類物質(zhì)作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素，可調(diào)節(jié)人體的基本生理功能，傳遞生理信號(hào)，其代謝物甲氧基腎上腺素(Metanephrine，MN)和甲氧基去甲腎上腺素(Nometanephrine，NMN)是腎上腺素和去甲腎上腺素的中間代謝產(chǎn)物，它們僅在腎上腺髓質(zhì)和PPGL內(nèi)代謝生成并且以高濃度水平持續(xù)存在，是PPGL的特異性標(biāo)記物，可以提高PPGL的檢出率，降低假陰性結(jié)果[2 - 6]。因此，測(cè)定血漿或尿液中的MN和NMN成為了診斷PPGL的首選生化檢測(cè)。尿液樣本檢測(cè)需要收集24 h的樣本，而血漿中的MN和NMN檢測(cè)更加適用于臨床。MN和NMN的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 MN(a)和NMN(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of MN (a) and NMN (b)

檢測(cè)血漿中MN和NMN的方法中，最常用的是高效液相色譜法及高效液相色譜和電化學(xué)聯(lián)用檢測(cè)法，但存在靈敏度低，樣本需求量大，前處理時(shí)間長(zhǎng)，組分干擾強(qiáng)等弊端，無(wú)法滿足臨床檢測(cè)需求[7 - 10]。基于免疫的檢測(cè)方法由于交叉反應(yīng)和非特異性的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)準(zhǔn)確度低，且不同的免疫測(cè)試，其結(jié)果不能相互比較，故不具備普適性[11]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)成為了定量檢測(cè)生物樣本中微量目標(biāo)分析物的強(qiáng)有力手段[12 - 14]。本文基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)血漿中的甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素進(jìn)行定量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AXR液相色譜儀(日本，島津公司)；API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB Sciex公司)；5427R離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf有限公司)；VORTEX-5旋渦混合器(其林貝爾儀器公司)；Multi SPE-M96固相萃取裝置(天津博納艾杰爾科技有限公司)；固相萃取微孔板(PWCX 96微孔板)規(guī)格為5 mg/1mL/well(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：甲氧基腎上腺素、甲氧基去甲腎上腺素(加拿大，Toronto Research Chemicals公司)；內(nèi)標(biāo)：甲氧基腎上腺素-d3鹽酸鹽、甲氧基去甲腎上腺素-d3鹽酸鹽(美國(guó)，Cambridge Isotope Laboratories公司)。甲醇、乙腈、甲酸銨、NH4Ac(美國(guó)，F(xiàn)isher Chemical公司)。高純水是符合國(guó)家際準(zhǔn)(GB/T 6682-2008)的一級(jí)水。

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的生物基質(zhì)為空白人血清(美國(guó)，Golden West Diagnostics公司)，待測(cè)血漿樣本采集自健康志愿者。

1.2 溶液的配制

稱取標(biāo)準(zhǔn)品甲氧基腎上腺素(MN)、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)各5 mg，用含甲酸的乙腈溶液進(jìn)行稀釋，得到20、50、200、500、800、2 000、4 000、5 000、10 000 pg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。甲氧基腎上腺素-d3鹽酸鹽(MN-d3)、甲氧基去甲腎上腺素-d3鹽酸鹽(NMN-d3)通過(guò)稀釋得到的濃度分別為400 ng/mL和800 ng/mL。

1.3 樣品處理

取500 μL待測(cè)樣品，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入500 μL的NH4Ac溶液，混勻后，采用固相萃取分離富集，主要步驟如下：(1)活化：先用200 μL甲醇活化，再用200 μL NH4Ac溶液活化。(2)上樣：把預(yù)處理的樣品分兩次上樣，每次500 μL，施加正壓全部壓下。(3)淋洗1：向每孔加入500 μL乙腈，正壓壓下。(4)淋洗2：向每孔加入500 μL水溶液，正壓壓下。(5)洗脫：向每孔中加入100 μL 2%甲酸乙腈溶液，正壓壓下收集。收集液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜柱：艾杰爾的Venusil XBP Silica柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流動(dòng)相：甲酸-甲酸銨溶液(A相)和甲酸-水-甲酸銨乙腈溶液(B相)。梯度洗脫程序：0～0.01 min，100%B；0.01～1.5 min，60%B；1.5～2.4 min，60%B；2.4～2.5 min，100%B；2.5～4 min，100%B。流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣(CUR)68.9 kPa，噴霧器(GS1)482.3 kPa，輔助加熱氣(GS2)344.5 kPa，溫度(TEM)550 ℃，離子化電壓(IS)5 500 V，碰撞氣(CAD)27.5 kPa。每種化合物的母離子、子離子、駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

通過(guò)柱后灌注法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]。測(cè)試的樣本包括用于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白血清樣本以及生物樣本。目標(biāo)分析物MN、NMN為內(nèi)源性小分子，在考察生物樣本的基質(zhì)效應(yīng)情況時(shí)以同位素內(nèi)標(biāo)(IS)的出峰行為推測(cè)目標(biāo)分析物的基質(zhì)影響情況。由圖2(a)可知，MN、MN-d3保留時(shí)間為2.10 min，NMN、NMN-d3保留時(shí)間為2.09 min；圖2(b)為空白人血清樣本，通過(guò)柱后灌注，可以看出在分析物的出峰位置2.09～2.10 min處，沒(méi)有出現(xiàn)如0.5～0.6 min明顯的信號(hào)下降趨勢(shì)，也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的信號(hào)上升趨勢(shì)。由此可判斷在分析物的出峰位置，沒(méi)有發(fā)生明顯的離子抑制或增強(qiáng)現(xiàn)象，故表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)；圖2(c)為人血漿樣本，由于分析物為內(nèi)源性物質(zhì)，故只需要考察同位素內(nèi)標(biāo)在出峰位置處的響應(yīng)程度，由圖可知在分析物的出峰位置2.09～2.10 min處，沒(méi)有出現(xiàn)如0.5～0.6 min、0.7～0.8 min明顯的信號(hào)下降和上升趨勢(shì)。由此可判斷在分析物的出峰位置，沒(méi)有發(fā)生明顯的離子抑制或增強(qiáng)現(xiàn)象，故表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(a)空白人血清柱后灌注標(biāo)準(zhǔn)品(b)和血漿柱后灌注內(nèi)標(biāo)(c)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard substance(a),post-column infusion of MN/NMN-free human serum(b) and post-column infusion of IS in plasma sample(c)

2.2 線性范圍及定量限

根據(jù)MN和NMN的臨床檢測(cè)需求確定檢測(cè)范圍[1]，以及優(yōu)化條件下濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積比值y為縱坐標(biāo)擬合工作曲線，結(jié)果呈良好的線性關(guān)系，如圖3。MN的線性范圍為50～10 000 pg/mL，線性方程式為：y=0.00151x+0.00766(R=0.9998)；NMN的線性范圍為50～10 000 pg/mL，線性方程式為：y=0.00432x-0.00633(R=0.9991)。此外，該檢測(cè)方法與其他方法相比，具有更寬的線性范圍，檢出時(shí)間更短(表2)，可以更好地滿足臨床的應(yīng)用需求。

圖3 MN(a)和NMN(b)的線性關(guān)系圖Fig.3 The linear equations of MN(a) and NMN (b)

表2 MN和NMN含量測(cè)定的不同方法比較

根據(jù)MN和NMN的臨床檢測(cè)需求[16]以及儀器的靈敏度，將方法的定量限(LOQ，S/N≥10)定為MN 20 pg/mL，NMN 20 pg/mL,每個(gè)濃度檢測(cè)10次，考察檢測(cè)值和理論值的偏差以及測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)(CV)(表3)。由結(jié)果可知準(zhǔn)確度偏差均在15%以內(nèi)，測(cè)試的平行樣本CV值在15%以內(nèi)，表明該方法的定量限MN為20 pg/mL、NMN為20 pg/mL符合臨床檢測(cè)方法學(xué)要求。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

選取低、中、高三個(gè)濃度評(píng)價(jià)方法的精密度，每個(gè)批次每個(gè)濃度樣本分5次進(jìn)行處理，連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次，總樣本數(shù)為45份，分別評(píng)估每個(gè)濃度樣本的批內(nèi)精密度和批間精密度以及總精密度。結(jié)果表明批內(nèi)精密度、批間精密度以及總精密度偏差均在15%以內(nèi)，表明該方法符合臨床檢測(cè)方法學(xué)要求。

采用真實(shí)混合人血漿的加標(biāo)回收率來(lái)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣，考察加標(biāo)回收率和檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)CV，見表3。由結(jié)果可知，加標(biāo)回收率均在±15%以內(nèi)，回收率的變異系數(shù)CV值在15%以內(nèi)。表明該方法的準(zhǔn)確度符合臨床檢測(cè)方法學(xué)要求。

表3 血漿中MN和NMN的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

建立了可以定量測(cè)定人血漿中甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素的分析檢測(cè)方法。結(jié)果表明該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)時(shí)間短，可以滿足臨床的檢測(cè)需求。