miR-183靶向DDR1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的分子機(jī)制

朱明珍 許瑾 徐靜 徐海燕 李秀翠 李德凡 邵華

(1連云港市第二人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 連云港 222000； 2南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部；3連云港市第二人民醫(yī)院甲乳外科)

乳腺癌是世界上最常見的女性惡性腫瘤之一，居世界女性癌癥死亡率第二位〔1〕。調(diào)查顯示，中國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，其增長速度遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家〔2〕。乳腺癌晚期極易發(fā)生肝肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差〔3〕。因此，精準(zhǔn)靶向治療的研究對乳腺癌患者具有重大意義。miRNA為內(nèi)源性短鏈非編碼小RNA，其長度為19～23個(gè)核苷酸，參與細(xì)胞的生物學(xué)過程，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及各種信號通路〔4〕。研究證實(shí)，miRNA參與各種癌癥的惡性進(jìn)程，發(fā)揮抑癌或促癌作用〔5〕。miR-183在多種癌癥中均出現(xiàn)異常表達(dá)，包括乳腺癌〔6〕。但miR-183在乳腺癌中的作用機(jī)制尚未十分清楚。盤狀結(jié)構(gòu)域受體(DDRs)包括DDR1、DDR2，在細(xì)胞增殖、黏附及基質(zhì)重塑中具有重要作用〔7〕，尤其腫瘤細(xì)胞〔8〕。DDR1在多種癌癥中均具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用，但其在乳腺癌中的作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究旨在探討miR-183在乳腺癌細(xì)胞中的功能及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、正常細(xì)胞MCF-10A均購自美國菌種保藏中心(ATCC)；胎牛血清購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海睿時(shí)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipor； ECL發(fā)光液購自北京康為世紀(jì)；RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、正常細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)時(shí)使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)增殖期的MDA-MB-231、MCF-10A細(xì)胞標(biāo)記為MDA-MB-231組、MCF-10A組。用3倍量的脂質(zhì)體將miR-183 mimics、miR-con、si-DDR1、si-con、miR-183+pcDNA、miR-183+pcDNA-DDR1轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染效率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后才可標(biāo)記為miR-183組、miR-con組、si-TCF7組、si-con組，miR-183+pcDNA組、miR-183+pcDNA-DDR1組用于后續(xù)試驗(yàn)。若未達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效果，則更換轉(zhuǎn)染條件或質(zhì)粒、DNA，再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，直至達(dá)到理想轉(zhuǎn)染效率為止。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)增殖期的各組細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA并將其合成cDNA。用qRT-PCR試劑盒檢測分析miR-183、DDR1的表達(dá)。結(jié)果用2-△△Ct計(jì)算miR-183、DDR1的表達(dá)。引物信息(5'-3')：miR-183上游引物：CGGTATGGCACTGGTAGAATTCACT；下游引物：GCTTTCCAATGCACTGACCATT；DDR1上游引物：ACTTTGGCATGAGCCGGAAC；下游引物：ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC；內(nèi)參U6和GAPDH的引物為通用引物。

1.5MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)增殖期的待檢細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整至105個(gè)/ml。取100 μl置于96孔板，再加入20 μl MTT溶液，孵育3 h后，再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，將結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀吸收光490 nm波長下檢測吸光度(A)。

1.6Western印跡實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)增殖期的待檢測細(xì)胞，加入蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白。12 000 r/min離心10 min，取上清稀釋后進(jìn)行沸水浴變性。用變性后的蛋白上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，4～5 h電泳結(jié)束。將膠上的蛋白在低溫下用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。結(jié)束后用2.5%脫脂奶粉室溫下封閉處理2 h。將膜用Ⅰ抗稀釋液在4℃條件下孵育過夜。再將膜轉(zhuǎn)移至Ⅱ抗稀釋溶液中37℃條件下孵育2 h。最后用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影曝光。用目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表達(dá)蛋白的表示情況。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)期需要檢測的細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12 h，調(diào)整至105個(gè)/孔，取100 μl細(xì)胞均勻涂抹到小室的上室內(nèi)，下室內(nèi)加入700 μl含血清細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。次日，取出小室，用棉簽輕輕拭去殘余的細(xì)胞。將膜用甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色，最后進(jìn)行封片。注意封片是需要將膜的下表面向上。顯微鏡下觀察小室下表面附著的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)數(shù)，取平均值。注意：檢測細(xì)胞遷移用的是不含基質(zhì)膠的Transwell小室，而檢測細(xì)胞侵襲用的是含有基質(zhì)膠的Transwell小室。細(xì)胞的侵襲檢測在操作步驟上完全相同，僅存在選用小室的差異。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 通過Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測DDR1與miR-183的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)DDR1-3'UTR WT和DDR1-3'UTR MUT，將其克隆至熒光載體psiCHECK2上，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體。再將其與miR-NC、miR-183共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞。按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書要求操作。記錄海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性。結(jié)果以海腎熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映miR-183與DDR1的結(jié)合力。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用PEMS3.2軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-183、DDR1在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá) 與MCF-10A組相比，MDA-MB-231組miR-183表達(dá)顯著降低，DDR1 mRNA和DDR1 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常細(xì)胞MCF-10A中DDR1的表達(dá)

表1 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常細(xì)胞MCF-10A中miR-183和DDR1的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-183抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)miR-183抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖

2.3過表達(dá)miR-183抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細(xì)胞遷移量和侵襲量均顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 過表達(dá)miR-183抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲個(gè))

2.4miR-183靶向DDR1 運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-183與DDR1 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)；與miR-con組相比，miR-183組WT-DDR1細(xì)胞中熒光活性顯著降低(表4)；miR-183能夠負(fù)向調(diào)控細(xì)胞中DDR1的表達(dá)水平(P<0.05)，其中miR-con組DDR1蛋白表達(dá)為1.05±0.08，miR-183組為0.33±0.06,anti-miR-con組為1.02±0.07，anti-miR-183組為1.54±0.11，見圖2。

1～4：miR-con組；miR-183組；anti-miR-con組；anti-miR-183組圖2 miR-183靶向DDR1 mRNA的3'UTR

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5敲減DDR1抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比，si-DDR1組MDA-MB-231細(xì)胞DDR1蛋白表達(dá)顯著降低，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中DDR1的表達(dá)

表5 培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)敲減DDR1抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲

2.6過表達(dá)DDR1和過表達(dá)miR-183對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-con組相比，miR-183組MDA-MB-231細(xì)胞DDR1蛋白表達(dá)顯著降低，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著降低(P<0.05)；與miR-183+pcDNA組相比，miR-183 pcDNA-DDR1組DDR1蛋白表達(dá)量顯著升高，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

1～4：miR-con組;miR-183組;miR-183+pcDNA組;miR-183+pcDNA-DDR1組圖4 檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中DDR1的表達(dá)

表6 培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)DDR1和過表達(dá)miR-183對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

miRNA參與基本細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)使其成為癌癥研究的前沿，在人類許多惡性腫瘤(包括乳腺癌)中失調(diào)，表明其可能作為新型癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生發(fā)展〔9,10〕。差異表達(dá)的miRNA鑒定及其功能作用的闡明可提供針對腫瘤發(fā)生的復(fù)雜分子機(jī)制的依據(jù)〔11〕。miR-183位于染色體7q32上，是miRNA家族的一部分，在許多癌癥中異常表達(dá)〔12〕。Luo等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中有11種差異表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)異常降低的miRNA包括miR-183，推測miR-183在乳腺癌中具有調(diào)控作用。吳正升等〔14〕闡明，miR-183在乳腺癌中表達(dá)異常降低，且過表達(dá)miR-183可上調(diào)乳腺癌細(xì)胞侵襲力，下調(diào)遷移力，對細(xì)胞活性變化不明顯，提示miR-183可能參與了乳腺癌細(xì)胞的惡性過程。Lowery等〔15〕報(bào)道，miR-183在乳腺癌中表達(dá)異常降低，且miR-183過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲，此外，miR-183靶向下調(diào)埃茲蛋白(Ezrin)，表明miR-183靶向VIL2在乳腺癌遷移和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中miR-183異常降低，且過表達(dá)miR-183可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與上述研究觀點(diǎn)相符合〔13～15〕；深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-183靶向負(fù)調(diào)控DDR1的表達(dá)，可能與miR-183在乳腺癌中的功能具有相關(guān)性。

DDR1也屬于一類膠原受體，其在多種腫瘤中表達(dá)異常升高〔16〕，參與腫瘤細(xì)胞的EMT化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕。有研究報(bào)道，DDR1在乳腺癌、肝癌、肺癌中均具有促進(jìn)癌癥進(jìn)一步惡化的作用〔18～20〕。Toy等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，DDR1在乳腺癌組織中高度表達(dá)，且定位于上皮-基質(zhì)界面處，還與乳腺癌的分級和預(yù)后相關(guān)，推測DDR1在乳腺癌中具致癌作用。楊婷等〔22,23〕研究表明，DDR1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且其受miR-199a的負(fù)向調(diào)控抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。Anhao等〔24〕在三陰性乳腺癌的研究中運(yùn)用Western印跡和熒光素酶報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p可靶向抑制DDR1的表達(dá)進(jìn)而抑制三陰性乳腺癌的增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)人乳腺癌細(xì)胞中DDR1的表達(dá)異常升高，且敲減DDR1可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；深入研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DDR1可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-183對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，說明DDR1能夠恢復(fù)miR-183在乳腺癌中的功能。不足之處在于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未在動(dòng)物體內(nèi)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，miR-183能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制之一可能為靶向DDR1，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。