雙靶向紫杉醇聚酰胺聚合物膠束體外抗腫瘤作用及機制

趙紅陽 王瑩 盛世東 姜琳 劉月平 趙慶蘭

(1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130021；2吉林省肝膽病醫(yī)院；3解放軍九六四醫(yī)院)

紫杉醇(PTX)最早是在紫杉的樹葉、樹皮、嫩枝等部位提取分離得到的天然物質(zhì)，是目前臨床上被廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物〔1～5〕。PTX的溶解性問題是其制劑的首要問題〔6～8〕。另外，PTX作為細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物，因為缺乏腫瘤靶向性，甚至導(dǎo)致全身性毒性〔7〕，特別是中性粒細(xì)胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應(yīng)用受到很大限制〔10～12〕。前期研究中已制備出以聚酰胺聚合物(PAMAM)-聚乙二醇(PEG)為骨架的葉酸(FA)/透明質(zhì)酸(HA)雙靶向載PTX膠束，載藥量為18.5%，本研究擬分析FA/HA雙靶向PTX-PAMAM膠束體外抗腫瘤作用及機制。

1 材料與方法

1.1試劑 PTX購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；PAMAM購自威海晨源分子新材料有限公司；透析袋、NH2-PEG2000-COOH均購自北京索萊寶科技有限公司；二甲亞砜、十水合四硼酸鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺、HA、FA、十八胺、N,N一二環(huán)己基碳二亞胺、甲酰胺、N,N一二甲基甲酰胺均購自麥克林；人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞株購自南昌樂悠生物科技有限公司。

1.2儀器 酶標(biāo)儀(Biocell)；超凈工作臺(AIR TECH)；倒置顯微鏡(OLYMPUS CK40)；流式細(xì)胞儀美國(BD公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(三洋電機株式會社)；激光共聚焦顯微鏡FV1000(Olympus公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗、10%胎牛血清，用于培養(yǎng)MCF-7心肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度處于70%～80%時，用含有0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中進(jìn)行實驗。

1.4MTT檢測細(xì)胞存活率 Control組(空白對照組加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)〕、膠束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)刺激12、24、48、72 h，進(jìn)行MTT檢測，采用96孔板接種細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106個/孔，培養(yǎng)24 h后給藥，進(jìn)行孵育，每孔加入20 ml MTT(5 g/L)，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的各孔OD值。細(xì)胞增殖率=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.5流式細(xì)胞儀檢測膠束的細(xì)胞攝取情況 采用6孔板接種細(xì)胞，分組給藥后，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后進(jìn)行封片，加入2 ml培養(yǎng)液運用流式細(xì)胞儀檢測熒光，流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長設(shè)置為488 nm。實驗分組：①時間依賴性梯度：膠束(10 μg/ml)刺激0.5 h、1.0 h、2.0 h、6.0 h、8.0 h、24.0 h。②膠束上的FA基團(tuán)與受體結(jié)合能力：Control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、FA(1、10、25 mg/ml)預(yù)處理1 h。③膠束的細(xì)胞內(nèi)吞機制：Control組、蔗糖組(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑，0.45 mol/L)、氯丙嗪組(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)陷抑制劑，10 μg/ml)、秋水仙堿組(巨胞飲抑制劑，10 μmol/L)、吲哚美辛組(小窩蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑，100 μmol/L)。

1.6共聚焦顯微鏡檢測膠束的胞內(nèi)定位 采用6孔板接種細(xì)胞，分組給藥后，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后進(jìn)行封片，加入2 ml培養(yǎng)液運用共聚焦熒光顯微鏡檢測熒光，膠束的熒光顯微鏡的激發(fā)波長設(shè)置為488 nm(綠色)，用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色，DAPI的激發(fā)波長為 358 nm(藍(lán)色)。實驗分組：溶酶體紅色熒光探針組、線粒體紅色熒光探針組、高爾基體紅色熒光探針組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針組。利用異硫氰酸熒光素(FITC)(綠色熒光)標(biāo)記膠束，ER-Tracker紅色熒光探針標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Golgitracker紅色熒光探針標(biāo)記高爾基體，Mitotracker紅色熒光探針標(biāo)記線粒體，Lysotracker紅色熒光探針標(biāo)記溶酶體，DAPI藍(lán)色熒光探針標(biāo)記細(xì)胞核，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中膠束與各類細(xì)胞器的熒光共定位。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1膠束對腫瘤細(xì)胞存活率的影響 體外培養(yǎng)MCF-7腫瘤細(xì)胞，用含膠束(0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/ml)培養(yǎng)基刺激細(xì)胞12、24、48、72 h，進(jìn)行MTT檢測。各組細(xì)胞生存率均呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性降低趨勢。見表1。

表1 各組刺激不同時間點MCF-7細(xì)胞活性

2.2膠束的細(xì)胞攝取 腫瘤細(xì)胞對膠束的攝取呈現(xiàn)時間依賴性增加趨勢(膠束刺激0.0、0.5、1.0、2.0、6.0、8.0、24.0 h細(xì)胞內(nèi)熒光密度分別為100%、119%、125%、128%、137%、135%、168%)；隨著FA濃度的增加，腫瘤細(xì)胞對膠束的攝取呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢(Control組、FA 1、10、25 mg/ml組細(xì)胞內(nèi)熒光密度分別為100%、98%、85%、59%)；較Control組(100%)，秋水仙堿組細(xì)胞攝取(76%)明顯降低(P<0.05)，氯丙嗪組、吲哚炎率組、蔗糖組(分別為102%、100%、101%)降低不明顯。

2.3膠束的細(xì)胞內(nèi)定位 膠束與溶酶體有較強的共定位，提示膠束入胞后大部分聚集在溶酶體中。見圖1。

膠束：FITC綠色熒光；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：紅色熒光；高爾基體：紅色熒光；線粒體：紅色熒光；溶酶體：紅色熒光；細(xì)胞核：DAPI藍(lán)色熒光圖1 膠束的細(xì)胞內(nèi)定位(×40)

3 討 論

惡性腫瘤已經(jīng)成為影響人類健康的主要疾病之一，化療是主要方法之一〔13～16〕，但化療藥物又存在缺乏靶向性和毒副作用大的缺陷。所以設(shè)計構(gòu)建毒副作用小，靶向性高的抗腫瘤靶向載體系統(tǒng)具有很好的藥學(xué)研究前景。

本文結(jié)果表明，膠束組細(xì)胞生存率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性降低趨勢。添加游離的FA可以有效地抑制膠束的攝取，游離的FA與膠束上的FA基團(tuán)競爭性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的FA受體，從而抑制了腫瘤細(xì)胞對膠束的靶向性攝取。腫瘤細(xì)胞對膠束的攝取依賴巨胞飲內(nèi)吞機制，內(nèi)吞后大部分膠束聚集在溶酶體中，而其具體作用機制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，F(xiàn)A/HA雙靶向PTX-PAMAM膠束在體外呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤作用，其作用機制與腫瘤細(xì)胞對膠束的靶向性攝取、巨胞飲內(nèi)吞作用及溶酶體聚集相關(guān)。