過表達(dá)miR-489-3p通過靶向調(diào)控MCM2抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

張明暉 孫雅麗 趙妍 牛意 白玉勤

(1錦州醫(yī)科大學(xué)赤峰市醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科)

肺癌是世界上死亡率和發(fā)病率都非常高的惡性腫瘤，呈逐年上升趨勢，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占絕大多數(shù)〔1〕。而傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療對肺癌的治療有一定的局限性和毒副作用，靶向治療可以針對某一特定位點(diǎn)直接殺死肺癌細(xì)胞或抑制其生長，療效好，副作用少，可用于治療肺癌，而更多的特定靶點(diǎn)是靶向治療急需的〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類長約22個(gè)堿基的非編碼RNA小分子，miRNA參與了細(xì)胞的分化、增殖、存活等調(diào)節(jié)過程，其異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后及耐藥密切相關(guān)，miRNA可作為肺癌診斷標(biāo)志及治療的特異性靶點(diǎn)〔3，4〕。miR-489-3p作為一種miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-489-3p通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)途徑抑制神經(jīng)元的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔5〕。miR-489在膀胱癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-489過表達(dá)抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔6〕。微小染色體維持蛋白(MCM)2是細(xì)胞增殖相關(guān)因子，只在處于細(xì)胞周期的細(xì)胞中表達(dá)，成熟和靜止期的細(xì)胞不表達(dá)，NSCLC中MCM2高表達(dá)，細(xì)胞具有更高增殖活性，MCM2反映NSCLC細(xì)胞的增殖能力，對判斷NSCLC的發(fā)展及預(yù)后具有一定的臨床意義，為NSCLC的靶向治療提供了潛在的靶點(diǎn)〔7〕。敲低MCM2抑制細(xì)胞周期蛋白D1和周期素依賴性激素(CDK)4表達(dá)，增加p21和p53表達(dá)，表明MCM2沉默引發(fā)細(xì)胞周期停滯，且還誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕。MCM2在結(jié)直腸癌中也高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤深度和Dukes分期呈正相關(guān)〔9〕。但miR-489-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，且miR-489-3p是否通過靶向調(diào)控MCM2的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-489-3p對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制與MCM2是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPC-A1和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞板、酶標(biāo)儀購自賽默飛公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPC-A1和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，含5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取常規(guī)培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至80 %融合，更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-489-3p組(轉(zhuǎn)染miR-489-3p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-MCM2組(轉(zhuǎn)染si-MCM2)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-489-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-489-3p)、miR-489-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-489-3p和pcDNA)、miR-489-3p+pcDNA-MCM2組(共轉(zhuǎn)染miR-489-3p和pcDNA-MCM2)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4qRT-PCR分析miR-489-3p及MCM2 mRNA表達(dá)水平 按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說明書進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.5Western印跡檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5 %脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min；再加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.6CCK-8法測定肺癌細(xì)胞增殖 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處OD值。細(xì)胞增殖活力(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%，每組重復(fù)3次取平均值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測miR-489-3p對MCM2的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示MCM2 3′非編碼區(qū)域(UTR)有miR-489-3p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)基因靶點(diǎn)MCM2的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-MCM2和MUT-MCM2)，取對數(shù)生長期肺癌A549細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，用LipofectamineTM2000將WT-MCM2和MUT-MCM2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-489-3p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-489-3p和MCM2在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá) 相較于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPC-A1中miR-489-3p的表達(dá)水平顯著降低，MCM2 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，肺癌細(xì)胞A549、H1299、SPC-A1中MCM2蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測MCM2蛋白表達(dá)

表1 miR-489-3p和MCM2在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細(xì)胞中miR-489-3p的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1表達(dá)水平顯著降低，p21、p27蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細(xì)胞的活力在48 h和72 h時(shí)顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.3miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved caspase)-3、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

表3 miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

2.4抑制MCM2表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-MCM2組A549細(xì)胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p21、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與si-NC組相比，si-MCM2組A549細(xì)胞活力在48 h和72 h時(shí)顯著降低(P<0.05)。與si-NC組相比，si-MCM2組A549細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見，抑制MCM2表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見表4，圖4。

表4 抑制MCM2表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖4 Western印跡檢測MCM2和增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5miR-489-3p靶向調(diào)控MCM2的表達(dá)(TargetScan在線軟件) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到MCM2與miR-489-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組WT-MCM2肺癌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表5。Western印跡檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組(0.58±0.05)比較，miR-489-3p組肺癌細(xì)胞中MCM2的表達(dá)水平(0.22±0.03)顯著降低；而與anti-miR-NC組(0.56±0.04)比較，anti-miR-489-3p組肺癌細(xì)胞中MCM2的表達(dá)水平顯著升高(0.93±0.09，P<0.05)。見圖5B。

A：MCM2的3′UTR中含有與miR-489-3p互補(bǔ)的核苷酸序列；B：MCM2蛋白表達(dá)圖5 miR-489-3p靶向調(diào)控MCM2的表達(dá)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6MCM2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細(xì)胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，p21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；而與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細(xì)胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，p21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細(xì)胞活力在48 h和72 h時(shí)顯著降低；與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細(xì)胞活力在48 h和72 h時(shí)顯著升高(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細(xì)胞凋亡率顯著升高；與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖6，表6。

1～4:MiR-NC組、miR-489-3p組、miR-489-3p+pcDNA組、miR-489-3p+pcDNA-MCM2組圖6 MCM2和增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表6 MCM2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制之一可能源于致癌啟動(dòng)基因的突變，因此，針對基因突變的靶向藥物治療的出現(xiàn)為肺癌治療提供了新的方向和新思路〔10〕。miRNA與肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡，侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性等密切相關(guān)，通過調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)和多種信號通路，參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為靶向治療靶點(diǎn)〔11〕。miR-489-3p在多種腫瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)可抑制腫瘤生長，是一種抑癌因子；有研究報(bào)道m(xù)iR-489-3p在骨肉瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，通過下調(diào)PAX3的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔12〕。miR-489-3p過表達(dá)還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲〔13〕。miR-489-3p通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔14〕。此外，miR-489-3p還可以預(yù)防缺血性腎損傷〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-489-3p在肺癌細(xì)胞中同樣低表達(dá)，miR-489-3p過表達(dá)可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)p21、cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)；抑制A549細(xì)胞增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

MCM蛋白家族是DNA復(fù)制中的必需因子，起關(guān)鍵作用，lnc-FTX與DNA復(fù)制許可因子MCM2結(jié)合，可阻礙DNA復(fù)制并抑制肝癌細(xì)胞增殖〔16〕。MCM2是非小細(xì)胞肺癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測因子〔17〕。乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高，且隨著腫瘤惡性程度的升高呈逐漸增高趨勢〔18〕；MCM2在子宮內(nèi)膜癌組織中高度表達(dá)，與腫瘤的分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔19〕。MCM2的高表達(dá)還與大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)〔20〕。本研究結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞中MCM2也顯著高表達(dá)，抑制MCM2表達(dá)可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)p21、cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)；抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而且miR-489-3p可靶向調(diào)控MCM2；MCM2過表達(dá)還逆轉(zhuǎn)了miR-489-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用。以上結(jié)果表明，miR-489-3p可能通過調(diào)控MCM2影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。