木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物減輕哮喘小鼠氣道炎癥的效果

藍(lán)凰齊 張世田 唐漢慶 黃小珊 李克明 林起慶

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2右江民族醫(yī)學(xué)院)

哮喘是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，氣道炎癥在哮喘發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用，哮喘發(fā)作期氣道高反應(yīng)性和臨床癥狀表現(xiàn)突出，而在哮喘緩解期，臨床癥狀盡管得到一定程度的控制，但氣道炎癥如果沒(méi)有得到有效緩解或治療，最終會(huì)導(dǎo)致氣道重塑和不可逆肺功能損害〔1,2〕。哮喘屬于疑難雜癥，根治的難度較大，民族傳統(tǒng)醫(yī)藥中有些療法和藥物對(duì)哮喘此類(lèi)疑難雜癥有較好的效果，木姜子和忍冬藤屬于壯族醫(yī)藥常用藥物，兩藥相伍民間用于減輕哮喘發(fā)作，對(duì)于木姜子和忍冬藤配伍用于哮喘治療，其起效機(jī)制是否通過(guò)減輕哮喘炎癥，抑制炎性細(xì)胞在肺組織浸潤(rùn)從而緩解氣道平滑肌痙攣，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立哮喘小鼠模型，觀察針挑療法及木姜子和忍冬藤配伍對(duì)哮喘小鼠相關(guān)炎癥因子水平的影響，探討其起效機(jī)制，為針挑療法及木姜子和忍冬藤配伍的應(yīng)用及促進(jìn)其在民族醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步交流提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只健康清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重18.56～23.22 g。由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證編號(hào):SCXK桂2017-0004)。實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理的有關(guān)準(zhǔn)則。

1.2藥物與試劑

1.2.1藥物 木姜子購(gòu)于廣西仁濟(jì)堂中藥飲片公司(批號(hào)151101)；忍冬藤購(gòu)于廣西張益堂中藥飲片有限公司(批號(hào)1602092)；將木姜子和忍冬藤按照1∶1比例，放到適量 70%食用乙醇里浸泡1 w，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮為濃度 100 mg/ml，灌胃時(shí)將濃度稀釋為 2 mg/ml。地塞米松購(gòu)于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司(批號(hào)H44024469)。

1.2.2主要試劑 白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10、免疫球蛋白(Ig)E、干擾素(IFN)-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒及鋅指蛋白(GATA)-3蛋白檢測(cè)試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為AK0017DEC27018、AK0017DEC27019、AK00-17DEC27023、AK0017DEC27026、AK0017DEC270-32、UB1702311)；OVA(Solarbio公司，批號(hào)1218B-031)；氫氧化鋁(Thermo公司，批號(hào)SG252318)。

1.3儀器 DU530型紫外分光光度儀(美國(guó)Beckman公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Labsystem 公司)；PowerPac HC 型電泳儀、chemidoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè))； 402B型超聲霧化器(上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；RM2245型切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司)。

1.4動(dòng)物分組、造模及給藥處理 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、木姜子和忍冬藤配伍低、中、高劑量組(低、中、高劑量組)、針挑療法組(針挑組)、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(陽(yáng)性組)7組，每組10只。參考文獻(xiàn)〔3〕造模方法。除空白組外，其他各組分別在實(shí)驗(yàn)第1、8天腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏液0.5 ml/只(含5 mg OVA和15 mg氫氧化鋁)。第15天開(kāi)始，將小鼠放入30 cm×30 cm×30 cm自制透明霧化箱中，每日通過(guò)霧化管向箱中噴入1 % OVA 30 min，霧量控制為0.5 ml/min，連續(xù)7 d。在霧化激發(fā)的同時(shí)，將小鼠置于溫度為-4～4℃的寒冷環(huán)境中，空調(diào)冷風(fēng)吹襲，每日30 min，連續(xù)7 d。空白組的致敏液和激發(fā)所有試劑以生理鹽水代替。造模過(guò)程中，進(jìn)行小鼠行為學(xué)觀察。造模小鼠在OVA溶液激發(fā)后開(kāi)始表現(xiàn)為煩躁不安，活動(dòng)頻繁，繼而呼吸急促，嚴(yán)重者縮胸、伸頸、收腹、大小便失禁，并隨著霧化和寒冷刺激天數(shù)的增加，小鼠飲食減少、毛色無(wú)光澤、行動(dòng)遲緩及體重逐漸下降，并在喘息表現(xiàn)基礎(chǔ)上出現(xiàn)惡寒、扎堆少動(dòng)，四肢不溫，弓背毛聳、噴嚏、流清涕、唇周發(fā)白等癥狀，而治療干預(yù)各組上述癥狀相對(duì)較輕，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔4〕，表明造模成功。

自激發(fā)第8天起，低、中、高劑量組每天分別給予5、10、20 mg/kg木姜子和忍冬藤的乙醇提取物灌胃，陽(yáng)性組給予地塞米松10 mg/(kg·d)；空白組和模型組給予等量的生理鹽水。針挑組選取定喘、肺俞、大椎、風(fēng)門(mén)、腎俞、脾俞穴位，用三棱針挑出皮下部分纖維組織。每天1次，7 d為1個(gè)療程，治療1個(gè)療程。療程結(jié)束后取材檢測(cè)指標(biāo)。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1炎癥因子指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠末次激發(fā)24 h后，用10%水合氯醛(無(wú)菌生理鹽水稀釋)腹腔注射麻醉，心臟取血，立即注入含有40 μl肝素的抗凝管中，2 000 r/min離心15 min，保存于-80℃冰箱中備測(cè)炎癥因子IL-4、IL-5、IL-10、IgE、IFN-γ，采用ELISA檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5.2GATA-3蛋白檢測(cè) 取右肺組織，勻漿，提取蛋白，Western印跡檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將條帶截圖，用 ImageJ 軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3肺功能檢測(cè) 末次治療干預(yù)結(jié)束后1 h，10%的水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠仰臥固定于鼠臺(tái)上，用剪切開(kāi)頸部皮膚并暴露氣管，以第2、3 環(huán)狀軟骨為標(biāo)志做橫行切口，插入膠管行氣管插管，用絲線(xiàn)結(jié)扎、將小鼠置于肺功能儀體描箱內(nèi)并連接動(dòng)物呼吸機(jī)實(shí)施機(jī)械通氣。進(jìn)行第0.1秒用力呼氣末容積(FEV0.1)、第0.2秒用力呼氣末容積(FEV0.2)、第0.4秒用力呼氣末容積占用力肺活量比值(FEV0.4/FVC)、呼氣峰流速(PEF)的肺功能指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.4肺組織形態(tài)學(xué)觀察 切取左肺組織用0.9%氯化鈉注射液洗凈，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，制作蠟塊，切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組炎癥因子指標(biāo)水平比較 和空白組比較，模型組血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平升高而IFN-γ 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；和模型組比較，針挑組、陽(yáng)性組和各劑量組血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平降低而IFN-γ水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組IgE、 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平比較

2.2各組肺功能比較 和空白組比較，模型組FEV0.1、FEV0.2、FEV0.4/FVC、PEF的肺功能指標(biāo)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。和模型組比較，針挑組、陽(yáng)性組和各劑量組均能改善肺功能，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3GATA-3蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 和空白組比較，模型組GATA-3蛋白表達(dá)升高；和模型組比較，針挑組、陽(yáng)性組和各劑量組均能糾正GATA-3蛋白過(guò)高表達(dá)(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組肺功能及GATA-3蛋白表達(dá)比較

M：Marker；1～7：模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性組、針挑組、空白組圖1 GATA-3蛋白表達(dá)電泳

2.4各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察 空白組支氣管、肺組織清晰，管壁光滑，無(wú)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)不清、管壁不光滑、有大片炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；針挑組、陽(yáng)性組和各劑量組肺泡間隔增厚不明顯，肺泡滲出物較少，黏膜下及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度也較輕，較模型組有明顯改善。見(jiàn)圖2。

圖2 各組肺組織形態(tài)學(xué)(HE,×200)

3 討 論

哮喘發(fā)生發(fā)展中的氣道高反應(yīng)性一直受到關(guān)注，其機(jī)制研究不斷深入，炎癥反應(yīng)起到重要作用，氣管和肺組織的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致黏液分泌和氣道高反應(yīng)性，長(zhǎng)期處于此種情況，將會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致氣道重塑不可逆性增加，使哮喘的治療變得更困難，這也是中醫(yī)學(xué)將“喘”列為疑難雜癥之一的原因。有醫(yī)學(xué)研究表明，在哮喘中，Th2型細(xì)胞炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-10等存在水平上升而Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ水平下降的現(xiàn)象〔5〕，其中IL-4作為炎癥介質(zhì)，刺激B細(xì)胞分泌IgE，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和聚集，引起炎癥的反應(yīng)擴(kuò)大，加重了氣道高反應(yīng)性并促進(jìn)其進(jìn)展。促炎因子IL-5或IL-10可刺激嗜酸性粒細(xì)胞的分化〔6〕，Th2型細(xì)胞炎癥因子的優(yōu)勢(shì)表達(dá)是哮喘發(fā)生發(fā)展炎癥反應(yīng)持續(xù)的重要原因。IFN-γ作為T(mén)h1型代表性細(xì)胞因子，已有研究表明其在加強(qiáng)機(jī)體免疫功能方面的重大作用，而且IFN-γ/IL-4的水平可反映Th1/Th2平衡，提高IFN-γ水平或降低IL-4水平可控制哮喘的炎癥反應(yīng)〔7〕，Th2型細(xì)胞炎癥因子的優(yōu)勢(shì)表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子的參與刺激，GATA-3作為T(mén)h2型細(xì)胞炎癥因子分泌的特異性轉(zhuǎn)錄因子已得到廣泛認(rèn)同，其高表達(dá)刺激Th2型細(xì)胞炎癥因子的分泌，考慮通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)從而控制哮喘炎癥反應(yīng)成為一種思路。

壯醫(yī)針挑療法是在壯醫(yī)理論指導(dǎo)下的臨床外治技法，是壯族醫(yī)藥的一種特色療法，一般采用消毒大號(hào)縫衣針根據(jù)不同疾病選取不同穴位作為挑刺點(diǎn)，挑出皮下一些纖維組織，具有所需器械簡(jiǎn)單及操作易學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)哮喘有較好的緩解作用，作為一種哮喘治療和肺康復(fù)的物理治療手段，在哮喘及肺康復(fù)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)受到關(guān)注和肯定。壯醫(yī)藥理論一般認(rèn)為其通過(guò)調(diào)節(jié)“谷道”、“水道”、“氣道”、“龍路”、“火路”五條道路(即“三道兩路”)起效〔8〕。本研究針挑組選取定喘、肺俞、大椎、風(fēng)門(mén)、腎俞、脾俞穴位，起到疏通氣道，同時(shí)對(duì)“谷道”、“水道”、“龍路”、“火路”也起到良性的刺激作用。木姜子和忍冬藤是常用的壯藥，民間傳統(tǒng)上將木姜子和忍冬藤等量配伍，再用小鍋米酒進(jìn)行浸泡，當(dāng)作保健滋補(bǔ)酒適量飲用，對(duì)哮喘有一定的緩解作用，相當(dāng)于民間經(jīng)驗(yàn)方，在壯族民間用于哮喘的治療。其中木姜子具有止咳平喘、解痙鎮(zhèn)攣、補(bǔ)虛強(qiáng)身作用，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為其具有抗炎〔9〕、提高免疫功能作用〔10〕。忍冬藤有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)作用，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為其具有抗炎〔11〕、抗氧化〔12〕、提高免疫功能〔13〕、舒張平滑肌作用〔14,15〕。本實(shí)驗(yàn)工作采用木姜子和忍冬藤配伍治療哮喘，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)炎癥因子指標(biāo)，觀察其起效機(jī)制，從而為其在中醫(yī)藥(民族醫(yī)藥)領(lǐng)域的交流和應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。本研究結(jié)果與近來(lái)報(bào)道〔16〕一致，提示針挑療法、木姜子和忍冬藤配伍治療哮喘，能夠調(diào)節(jié)GATA-3表達(dá)，通過(guò)減輕哮喘炎癥，抑制炎性細(xì)胞在肺組織的浸潤(rùn)從而改善肺功能而起效，但對(duì)于其調(diào)節(jié)GATA-3表達(dá)的更上游機(jī)制，仍需要下一步的研究。