類風濕關(guān)節(jié)炎合并干眼病患者血清中差異蛋白的分析

李曉玲 武艷梅

(1錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院)

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種累及全身多系統(tǒng)的慢性進行性自身免疫性疾病，其主要臨床特征為滑膜關(guān)節(jié)的慢性炎癥性病變，并合并關(guān)節(jié)外多器官病癥〔1,2〕。干眼病(DED)是一種淚液和眼表疾病〔3〕，是RA最常見的眼部病癥，其在RA患者中發(fā)病率可達19%～31%〔4〕，并常因未能及時發(fā)現(xiàn)和得到有效治療導(dǎo)致RA合并DED患者失明，使患者的生活質(zhì)量受到嚴重影響。因此，早期發(fā)現(xiàn)RA患者的眼部病變，對于患者的治療和預(yù)后非常重要。本研究通過非標記(Label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選RA合并DED患者血清中差異蛋白，并分析其功能及參與RA合并DED發(fā)病的生物學(xué)過程，為尋找診斷RA合并DED的早期血清學(xué)標志物及進一步探討RA合并DED的發(fā)病機制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院風濕免疫科確診為單純RA患者20例作為對照組，男7例、女13例，平均年齡(54.5±5.39)歲；同時選取RA(病程1～20 年，平均10年)合并DED患者20例作為觀察組，男4例、女16例，平均年齡(56.8±4.92)歲。經(jīng)統(tǒng)計，兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。該研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會討論通過，所有患者或其監(jiān)護人對本研究知情，并簽署了知情同意書。

1.2入選標準 納入標準：RA診斷依據(jù)2010年美國風濕病學(xué)會(ACR)/歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)關(guān)于RA新分類標準〔5〕；RA合并DED診斷依據(jù)2013年中華醫(yī)學(xué)會眼科學(xué)分會角膜病學(xué)組《干眼臨床診療專家共識(2013 年)》中提出的干眼診斷標準〔6〕。排除標準：高血壓、糖尿病及心、腦血管疾病等全身疾病者；患有其他自身免疫性疾病、急慢性感染，腫瘤病史、肝腎損害者；1年內(nèi)有激素和免疫抑制劑等特殊用藥史者。

1.3主要試劑和儀器 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，其余試劑均購自Bio-Rad公司。C18 Cartridge(SPEC18柱)、C18 上樣柱、C18分析柱、納升級液相色譜儀(EASY-nLC 1000)、Q Exactive質(zhì)譜儀均購自Thermo Scientific公司，MaxQuant (版本號1.5.3.17)分析軟件購自德國的Max Planck 生物化學(xué)研究所，電泳系統(tǒng)(EPS200)和化學(xué)發(fā)光儀(Tanon 4600)全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)均購自上海天能科技有限公司。

1.4蛋白的提取和酶解 采集所有患者空腹靜脈血3 ml，離心、分離血清。用Sartorius超濾管(10 kD)對血清樣本進行超濾濃縮后，加入SDT 裂解液：4%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)和0.1 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，將樣品置沸水浴裂解 15 min；取出樣品，上離心機，14 000 r/min離心20 min，提取上清液中的蛋白；用BCA檢測法測定蛋白濃度；取100 μg蛋白，加入胰蛋白酶(1∶50)，用超濾輔助樣品制備(FASP)方法進行胰蛋白酶酶解；用C18 Cartridge對酶解后的肽段進行脫鹽后，凍干肽段；用40 μl 0.1%甲酸溶液復(fù)溶凍干后肽段，于光密度A280下測定肽段濃度。

1.5數(shù)據(jù)采集 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。取凍干后肽段2 μg，用40 μl 0.1%甲酸溶液復(fù)溶后，用納升級液相色譜儀(EASY-nLC1000)對肽段進行分離，色譜條件：采用C18-A2色譜柱(10 cm×75 μm，3 μm)，以0.1%甲酸水溶液(緩沖液A)-0.1%甲酸乙腈溶液(緩沖液B)為流動相，流速300 ml/min，柱溫55℃，進樣量4 μl。用Q-Exactive質(zhì)譜儀對分離后的肽段進行分析，質(zhì)譜條件：掃描方式為正離子和自動獲取數(shù)據(jù)模式，電壓2 100～2 400 V，一級掃描范圍為300～1 800 m/z、一級分辨率為70 000 at 200 m/z、自動獲取控制目標為1e6、最大駐留時間為50 ms、動態(tài)排除時間為60.0 s；采集多肽和多肽碎片質(zhì)量電荷比的方法和條件：每次對肽段全掃描后，采集20個碎片圖譜，MS2激活類型為高能誘導(dǎo)碰撞解離方式(HCD)，其中隔離窗為2 m/z、二級質(zhì)譜分辨率為17 500 at 200 m/z、碰撞能量為30 eV、底部填充劑為0.1%。

1.6蛋白的鑒定和定量分析 采用MaxQuant軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，并對蛋白質(zhì)進行鑒定和定量分析，其質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，以倍數(shù)上調(diào)>2倍或下調(diào)<0.5倍，且P<0.05的標準篩選差異蛋白質(zhì)。

1.7生物信息學(xué)分析 采用Blast 2GO軟件對差異蛋白質(zhì)進行基因功能(GO)注釋，通過Fisher精確檢驗后，對差異蛋白質(zhì)進行GO注釋的富集分析，用Cluster3.0軟件對差異蛋白質(zhì)的表達量進行層次聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1蛋白鑒定和定量分析結(jié)果 本研究共鑒定到蛋白345種，對照組297種，觀察組298種，兩組間共有320種蛋白發(fā)生重疊(圖1)。通過定量分析，以觀察組/對照組蛋白表達差異倍數(shù)上調(diào)>2倍或下調(diào)<0.5倍且P<0.05的篩選標準，共篩選出13種差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白9種、下調(diào)蛋白4種，見圖1、表1。

A：對照組；B：觀察組；橫坐標為差異倍數(shù)(以2為底的對數(shù)變換)，縱坐標為差異顯著性(以10為底的對數(shù)變換)，橫、縱坐標值距離 0 點越遠表示差異越大；紅色圈為差異表達蛋白(倍數(shù)大于2.0倍，且P<0.05)，黑色圈為無差異變化蛋白圖1 蛋白定量結(jié)果火山圖

表1 差異蛋白

2.2生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1差異蛋白GO功能的富集分析結(jié)果 篩選出來的13種差異蛋白主要參與多細胞生物過程、女性妊娠、外源凋亡信號通路的負調(diào)控、外源凋亡信號通路的調(diào)控和凋亡信號傳導(dǎo)通路負調(diào)控等重要的生物學(xué)過程(BP)，同時還參與細胞內(nèi)非膜結(jié)合細胞器、超分子纖維、超分子復(fù)合物、非膜結(jié)合細胞器和超分子聚合物等細胞組分(CC)，并具有寡糖結(jié)合等分子功能(MF)，見圖2。

顏色梯度代表P值大小，條形圖上方是富集因子圖2 富集分析的差異蛋白前20位

2.2.2差異蛋白聚類分析結(jié)果 以倍數(shù)上調(diào)>2倍或下調(diào)<0.5倍，且P<0.05篩選標準得到的差異蛋白可有效地將兩組分開，表明本研究差異表達蛋白篩選的合理性和準確性，見圖3。

A：對照組；B：觀察組；橫坐標為樣本，縱坐標為差異蛋白；圖中每個小方格代表一種蛋白，紅色部分為上調(diào)蛋白、藍色部分為下調(diào)蛋白，表達量越多顏色越深；每行為每個蛋白在不同組中的表達量情況，每列為每個組中所有差異蛋白的表達量情況；上方樹形圖為觀察組和對照組數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果，左側(cè)樹狀圖為不同蛋白數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果 圖3 差異蛋白聚類分析結(jié)果樹形熱圖

3 討 論

非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜分析，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號強度，從而對肽段對應(yīng)的蛋白進行相對定量，篩選目的蛋白，其近年來廣泛被用于差異蛋白的研究〔7，8〕。本研究共篩選出了13種差異蛋白，9種蛋白表現(xiàn)為上調(diào)、4種蛋白表現(xiàn)為下調(diào)。

PRDX2是一種重要的抗氧化劑，通過抗氧化活性參與細胞的炎癥和免疫反應(yīng)，在免疫調(diào)節(jié)中充分發(fā)揮氧化還原酶的作用〔9〕。有研究表明，氧化損傷和炎癥反應(yīng)共同參與了DED的發(fā)病，在實驗動物飼料中加入抗氧化劑后，則發(fā)現(xiàn)實驗動物眼表上皮細胞的氧化損傷減輕〔10〕。SAA是由肝細胞產(chǎn)生的一種急性時相蛋白，當機體發(fā)生炎癥感染或損傷時，其可迅速升高，如RA、糖尿病腎病等患者血清中SAA含量明顯升高，是診斷機體炎癥感染的一個靈敏指標〔11～14〕，有學(xué)者認為炎癥反應(yīng)是各類型DED發(fā)病的共同機制〔15，16〕。SAA1是SAA家族中的一員，共有SAA的生物學(xué)特性。本研究結(jié)果表明RA合并DED患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，二者均可作為診斷RA合并DED的早期血清學(xué)標志物。

REG為免疫炎癥調(diào)節(jié)因子，在炎癥、腫瘤等多種疾病或受損組織中均有表達，具有促進細胞增殖、分化和抑制細胞凋亡的生物功能〔17〕，其高表達可引起自身免疫性疾病的發(fā)生，并促進病情的發(fā)展，因此又被認為是一種自身抗原〔18〕。 REG3α為REG 家族中一員，具有抗炎等保護作用〔19〕。補體因子(CF)H和CFHRP是補體系統(tǒng)激活途徑中的調(diào)節(jié)因子，CFH 在補體活化過程中起抑制作用，CFHRP通過與CFH競爭性結(jié)合補體 C3b，從而影響 CFH 對補體的抑制功能〔20，21〕。一些自身免疫性和炎癥性疾病的病理過程與補體的過度激活和抑制不足相關(guān)，如RA患者關(guān)節(jié)滑液中補體持續(xù)激活〔22〕。CFHRP3是CFH家族的一員，可通過與CFH競爭性結(jié)合C3b，促進補體的激活〔23，24〕。

本研究首次在RA合并DED患者血清中檢測到REG3α和CFHRP3，且均顯示為上調(diào)，我們將在后續(xù)的研究中驗證二者能否作為診斷RA合并DED的早期血清學(xué)標志物。Ig也稱抗體，是機體體液免疫應(yīng)答時B細胞產(chǎn)生的重要免疫效應(yīng)分子，在機體抵抗外來病原體中發(fā)揮著重要的作用。Ig由5條重鏈(H鏈，分為γ鏈、α鏈、μ鏈、δ鏈、ε鏈)和2條輕鏈(L鏈，分為κ型和λ型)組成，L鏈陽性或升高多見于多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病、巨球蛋白血癥、淀粉樣變性等〔25～27〕，H鏈升高多見淋巴細胞和漿細胞的惡性腫瘤〔28，29〕。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者體內(nèi)存在B細胞反應(yīng)，產(chǎn)生抗瓜氨酸化蛋白抗體 (ACPA)等自身免疫抗體，參與RA的病理改變〔30，31〕；干燥綜合征、RA等自身免疫系統(tǒng)性疾病患者機體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，眼成為自身抗體攻擊的靶器官，淚腺被大量的淋巴細胞浸潤，腺體分泌功能障礙，從而導(dǎo)致嚴重的DED〔32〕。本研究結(jié)果表明這些Ig均可能參與了RA合并DED發(fā)病過程中的體液免疫反應(yīng)，因處于不同的病理改變時期或B細胞分化的不同階段，故表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)，在診斷RA合并DED時，可作為血清學(xué)參考標志物。

LP(a)為富含膽固醇的血漿脂蛋白，主要在肝臟中合成，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞趨化因子 I-309 活性的增加，導(dǎo)致血管壁損傷和炎性反應(yīng)〔33〕，同時Lp對于哺乳動物細胞外脂質(zhì)的包裝、儲存、運輸和代謝起著重要作用，脂質(zhì)是淚膜的關(guān)鍵組成部分，主要是維持角膜表面光滑并防止眼表淚液過分蒸發(fā)。本研究結(jié)果表明RA合并DED患者體內(nèi)可能存在脂質(zhì)代謝紊亂的生物過程，使淚膜脂質(zhì)含量發(fā)生了變化，導(dǎo)致瞼板腺功能障礙，引起淚膜不穩(wěn)定，而發(fā)生DED，所以LP(a)上調(diào)可作為診斷RA合并DED的一個血清學(xué)參考指標。妊娠區(qū)蛋白(PZP)是人血漿中一種大分子糖蛋白，與α-1巨球蛋白(α1M)、α-2巨球蛋白(α2M)及補體C3、C4、C5同屬于人類α巨球蛋白家族(αMS)，存在人腦脊液、關(guān)節(jié)滑液和血液中。PZP與α2M具有同源性，具有廣譜的蛋白酶抑制作用，在IL-6、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF) 等細胞因子免疫應(yīng)答反應(yīng)和肝抗菌肽、瘦素等激素調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用〔34，35〕。本研究首次在RA合并DED患者血清中檢測到PZP，顯示為表達下調(diào)，其可能參與了RA合并DED發(fā)病過程，是否能作為診斷RA合并DED早期血清學(xué)標志物，兩作進一步的研究進行驗證。

血紅蛋白(Hb)是動物體內(nèi)最重要的呼吸蛋白之一，主要在脊椎動物的紅細胞內(nèi)表達，不僅具有儲存能量、維持滲透壓、抗菌和發(fā)揮類酚氧化酶活性等多種生物功能，同時在宿主抵抗病原體入侵、調(diào)控機體天然免疫應(yīng)答過程中也發(fā)揮了重要作用〔36〕。正常人有3種血紅蛋白：HbA、HbF、HbA2，HbA為成人紅細胞中的主要血紅蛋白，分為HbA1、HbA2、HbF，其中HbA1是血紅蛋白在代謝過程中與葡萄糖相結(jié)合的產(chǎn)物，與血液中葡萄糖水平成正比，因此可間接反映機體糖代謝情況〔37〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在RA合并DED患者血清中HbA1表達為下調(diào)，其是否與RA合并DED患者淚液滲透壓升高、角膜上皮細胞屏障遭到破壞、細胞活性降低等生物過程相關(guān)，能否作為診斷RA合并DED早期血清學(xué)標志物，將作進一步的研究。