阿爾茨海默病患者外周血差異基因的生物信息學特征分析

張波 白勇濤 劉洪濤 衛(wèi)東鋒 任建廷 張俊英 張占軍 趙雪松

(1香河園社區(qū)衛(wèi)生服務中心檢驗科，北京 100028；2中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所；3北京師范大學認知神經(jīng)科學與學習國家重點實驗室；4北京師范大學老年腦健康研究中心；5首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，多發(fā)于老年人，是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床以進行性記憶和認知功能下降、行為異常、社交障礙及睡眠障礙等為主要表現(xiàn)，主要病理特征包括老年斑形成、神經(jīng)元纖維纏結、海馬錐體細胞顆?？张葑冃约吧窠?jīng)元丟失等〔1，2〕。目前外周體液標志物的研究已成為AD領域的熱點問題。由于腦脊液中Aβ和Tau的含量檢測具有一定創(chuàng)傷性無法廣泛開展，而人體外周血作為早期AD診斷、篩查的標志物，具有創(chuàng)傷小，易取樣，適合在社區(qū)衛(wèi)生服務中心、醫(yī)院、養(yǎng)老院等廣泛開展。在人體外周血中篩選更為敏感的生物標志物是一種具有潛力和臨床應用價值的方法〔3，4〕，具有重要的應用前景，將對AD的早期篩查和診斷產(chǎn)生重要影響?；蚪M學檢測方法為AD的病理機制研究及抗AD藥物研發(fā)提供了大量的臨床數(shù)據(jù)，采用生物信息學分析方法對這些臨床檢測數(shù)據(jù)進行深入分析，探討AD疾病外周血早期的糖脂代謝變化特征，可為AD疾病的早期篩查、診斷、治療及實驗研究提供科學依據(jù)〔5〕。

本研究利用來自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)一組AD患者外周血具有明顯差異的基因數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，深入探討早期AD外周血的糖脂分子功能及蛋白網(wǎng)絡改變情況，以期為早期AD的發(fā)病機制及藥物防治提供理論依據(jù)和臨床參考。

1 材料與方法

1.1差異明顯的基因表達數(shù)據(jù) 在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“血液和阿爾茨海默病”為檢索詞，獲得GSE97760和GSE4229基因芯片數(shù)據(jù)。GSE97760由美國Agilent 科技公司生產(chǎn)的Sureprint G3 Human Gene Expression 8x60k v2基因芯片檢測，基因數(shù)據(jù)分別來自9例AD患者和10例健康老年人。GSE4229為人外周血單個核細胞基因芯片數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)由NIA Human MGC cDNA基因芯片檢測，基因數(shù)據(jù)分別來自18例AD患者和22例正常老年人。AD患者血液中表達明顯下調和上調的差異基因列表見表1，然后進行生物信息學分析。

表1 AD患者血液中表達下調及上調的差異基因

1.2方法

1.2.1差異表達基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡分析 分別將20個表達下調和上調的明顯差異基因相應的蛋白ID號上傳至STRING9.05 PPI關系在線分析網(wǎng)站(http://www.string-db.org)，通過調節(jié)可信度和附加節(jié)點參數(shù)，獲得差異表達基因的PPI拓撲網(wǎng)絡圖譜及團簇功能分類網(wǎng)絡圖譜，并篩選出各子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點蛋白。

1.2.2差異表達基因的分類及分子功能分析 分別將20個表達下調和上調的明顯差異基因ID號上傳至PANTHER 8.1在線分類系統(tǒng)(http://www.pantherdb.org)，通過調節(jié)數(shù)據(jù)種屬類型及分析類型參數(shù)，調節(jié)結果展示圖形類別，分別獲得上調和下調差異基因表達蛋白的分類、基因分子功能分類結果，進一步查看各分類中詳細基因名稱及相關信息，對分類結果進行整理。

1.2.3差異表達基因的生物學過程及信號通路分析 在上述數(shù)據(jù)上傳的基礎上，進一步調節(jié)分析參數(shù)及結果展示類型，點擊各生物學過程及信號通路分析結果，進一步查看各生物學過程中所包含的所有基因名稱及其詳細信息，并查看每條信號通路中所涉及的基因數(shù)量、基因名稱等相關信息。

2 結 果

2.1下調基因的PPI拓撲網(wǎng)絡及團簇網(wǎng)絡分析結果 如圖1所示，STRING蛋白相互作用在線分析結果表明，下調的20個基因表達的蛋白之間存在相互作用關系，構成的蛋白拓撲網(wǎng)絡中包含3個子網(wǎng)絡，分別與能量代謝、信號傳導、氧化應激密切相關。其中，ATP6V1F為能量代謝子網(wǎng)絡的中心節(jié)點，與子網(wǎng)絡中其他16個蛋白存在相互作用關系。PIGQ與信號傳導子網(wǎng)絡中的4個信號傳導蛋白存在相互作用關系，為關鍵節(jié)點。SLC2A5與網(wǎng)絡中的兩個蛋白存在相互作用關系。GP6與網(wǎng)絡中的GP1BB蛋白存在相互作用關系，GLO1為子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點，與AK1、HAGH存在相互作用關系。下調基因表達蛋白相互作用拓撲網(wǎng)絡中預測的相關功能蛋白見表2，表中列出了10個預測蛋白的全稱及所含氨基酸數(shù)目。而下調基因的PPI功能團簇網(wǎng)絡分析結果見圖2，包含3個功能團簇。

2.2上調基因的PPI拓撲網(wǎng)絡及團簇網(wǎng)絡分析結果 如圖3所示，STRING蛋白相互作用在線分析結果表明，上調的20個基因表達的蛋白之間存在相互作用關系，構成的蛋白拓撲網(wǎng)絡中包含5個子網(wǎng)絡，分別與糖基化修飾、糖原合成、丙三醇代謝、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代謝密切相關。其中，OGT為糖基化修飾相關子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點，與子網(wǎng)絡中的其他3個蛋白MGEA5、HCFC1、WDR5存在相互作用關系。GYG1為糖原合成子網(wǎng)絡的中心節(jié)點，與子網(wǎng)絡中的其他10個蛋白存在相互作用關系。UXS1為葡萄糖醛酸酯合成相關子網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點，與子網(wǎng)絡中的其他4個蛋白B3GALNT2、POMK、ATPIF1、UGDH存在相互作用關系。ATP2A2為ATP能量代謝子網(wǎng)絡的中心節(jié)點，與子網(wǎng)絡中的其他7個蛋白ATP2A1、ATP2A3、ATP1B1、ATP1A4、ATP1A2、ATP1A1、FXYD2存在相互作用關系。上調基因表達蛋白的相互作用網(wǎng)絡中預測的相關功能蛋白見表2，表中列出了10個預測蛋白的全稱。上調基因的PPI團簇網(wǎng)絡分析結果見圖2，包含3個功能團簇。

圖1 下調基因的PPI相互作用拓撲網(wǎng)絡

下調基因

上調基因

2.3下調基因的GO分類結果 下調基因的GO分類結果包括蛋白分類(蛋白總數(shù)20，分類匹配數(shù)目16)、分子功能(蛋白總數(shù)20，功能匹配數(shù)18)、生物學過程(蛋白數(shù)20，過程匹配數(shù)18)及信號通路(蛋白總數(shù)20，通路匹配數(shù)目4)。

2.3.1下調基因的蛋白分類及分子功能分析結果 PANTHER平臺蛋白分類結果表明，下調基因表達的蛋白可分為8個類別，每種類別包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。PANTHER平臺分子功能分類結果表明，下調基因的分子功能可分為4個類別，每種分子功能包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表4。

圖3 上調基因的PPI網(wǎng)絡

2.3.2下調基因的生物學過程及信號通路分析結果 PANTHER平臺生物學過程分類結果表明，下調基因的生物學過程可分為6個類別，每種生物學過程包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表4。

2.4上調基因的GO分類結果 上調基因的GO分類結果包括蛋白分類、分子功能、生物學過程及細胞組分。

2.4.1上調基因的蛋白分類及分子功能分類結果 PANTHER平臺蛋白分類結果表明，上調基因表達的蛋白可分為6個類別，每種類別包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。上調基因的分子功能可分為4個類別，包括結合活性、催化活性、分子調節(jié)及轉運活性，每種分子功能包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表5。

表3 下調基因及上調基因表達蛋白的分類結果

表4 下調基因的生物信息學分析

2.4.2上調基因的生物學過程及細胞組分分類 PANTHER平臺生物學過程分類結果表明，上調基因的生物學過程可分為4個類別，每種生物學過程包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表5。

表5 上調基因的生物信息學分析

3 討 論

AD是一種病因較多、病程較長、危險因素較多、發(fā)病機制較為復雜的神經(jīng)退行性疾病，由于其發(fā)病機制研究尚未有定論，因此目前仍缺乏有效的治療方法〔6,7〕。已有研究表明，由β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集所形成的老年斑和Tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結是AD的主要病理特征，寡聚化的Aβ對神經(jīng)細胞具有明顯毒性作用，其機制與線粒體能量代謝障礙、氧化應激損傷、炎癥反應、突觸損傷、Tau蛋白磷酸化、細胞凋亡及細胞代謝紊亂密切相關〔8〕。Tau蛋白過度磷酸化可導致神經(jīng)細胞微管結構穩(wěn)定性下降、神經(jīng)纖維纏結、囊泡轉運功能失調及軸突轉運障礙，從而引起神經(jīng)細胞損傷或丟失〔9〕。線粒體能量代謝紊亂是AD早期發(fā)生的主要原因之一，進而導致脂代謝和氨基酸代謝紊亂，引起神經(jīng)細胞微環(huán)境紊亂，神經(jīng)網(wǎng)絡功能重塑，以維持大腦的正常生理功能〔10〕。

本研究中基因數(shù)據(jù)來源于AD患者血液，差異基因主要與能量代謝密切相關。下調基因表達的蛋白主要與轉移酶、水解酶、轉運分子、細胞黏附分子、防御/免疫蛋白密切相關，分子功能主要與催化活性、轉運活性、結合活性密切相關，涉及的生物學過程主要與能量代謝過程、細胞過程、免疫系統(tǒng)過程及定位過程密切相關，如Na+/K+轉運三磷酸腺苷酶β2多肽、氫離子轉運三磷酸腺苷酶V1亞基、丙酮酸羧化酶、甘露糖(α-1,3-)-糖蛋白-2-N-乙酰葡萄糖胺轉移酶、溶質載體家族2促葡萄糖轉運體成員A5、溶質載體家族5促葡萄糖轉運體成員A2。而上調基因表達的蛋白主要與轉移酶、轉運分子、氧化還原酶、分子伴侶、連接酶密切相關，分子功能主要與催化活性、轉運活性及分子調節(jié)密切相關，涉及的生物學過程主要與代謝過程、細胞過程、生物調節(jié)過程及定位過程密切相關，如鈣離子轉運三磷酸腺苷酶、溶質載體家族5促葡萄糖轉運體成員A3、丙三醇激酶、線粒體丙三醇-3-磷酸鹽?；D移酶、線粒體丙三醇-3-磷酸脫氫酶2、增強內(nèi)質網(wǎng)降解的甘露糖苷酶樣蛋白3等。PANTHER平臺GO分析結果表明，AD病理過程中，機體線粒體能量代謝、免疫系統(tǒng)防御功能及細胞轉運能力明顯下降，而機體的生物調節(jié)能力、分子調節(jié)能力及氧化應激反應等代償性調節(jié)能力明顯增強。這可能是機體出現(xiàn)損傷后的一種局部功能重塑，通過基因的整體變化達到新的代謝平衡。

STRING PPI網(wǎng)絡分析結果表明，AD患者血液中的差異基因表達的蛋白之間存在相互作用關系，下調基因表達蛋白的PPI蛋白子網(wǎng)絡與能量代謝、信號傳導、氧化應激密切相關，而上調基因表達蛋白的PPI蛋白子網(wǎng)絡與糖基化修飾、糖原合成、丙三醇代謝、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代謝密切相關，其中ATP6V1F、PIGQ、GLO1、OGT、GYG1、UXS1、ATP2A2作為PPT網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點值得進一步深入研究，為AD的早期篩查和診斷提供線索和依據(jù)。

本研究差異基因的生物信息學分析結果表明，AD患者外周血中的差異基因主要涉及催化活性、轉運活性、結合活性及分子調節(jié)功能，通過調節(jié)AD丙酮酸代謝、血凝、嘌呤生物合成信號通路參與能量代謝過程、細胞過程、免疫系統(tǒng)及細胞定位生物學過程，為早期AD患者的外周血早期篩查及診斷研究提供了新思路和防治靶標。綜上所述，本研究應用生物信息學方法對AD患者血液中表達下調和上調的差異基因進行了深入分析，篩選出了其中7個重要調節(jié)基因，以細胞信號轉導通路為主，針對這些差異基因進行深入研究，將有助于進一步揭示AD在早期階段的發(fā)病機制。