miR-200a在乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭患者血清中的表達及其與預后的關系

吳炳 張涵斌 柯淑慧 池宏波

(1浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310000；2臺州市椒江區(qū)婦幼保健院檢驗科；3臺州市黃巖區(qū)婦幼保健院檢驗科；4臺州市恩澤醫(yī)療中心恩澤醫(yī)院檢驗科)

慢加急性肝衰竭(ACLF)是一種嚴重的肝臟損傷，病死率極高。臨床主要表現(xiàn)為黃疸和凝血障礙，并合并有肝性腦病、腹水等并發(fā)癥〔1〕。ACLF的病變基礎可能是肝硬化，也可能是無肝硬化的慢性肝病，ACLF 28 d死亡率高達33%，是其他慢性肝病的15倍〔2〕。我國ACLF最常見的病因是乙型肝炎病毒(HBV)感染，被稱之為HBV-ACLF〔3〕。常用的評估和預后手段如終末期肝病模型(MELD)和Child-Pugh評分，均不是專門為ACLF設計的。因此制定正確治療方案和準確評估ACLF患者的預后是治療ACLF的關鍵，這樣才能有效降低ACLF患者死亡率。由于HBV-ACLF預后很差，所以迫切需要篩選出新的潛在生物標志物來診斷和預測HBV-ACLF患者的預后，為臨床治療方案提供實驗基礎。微小RNA(miRNA)是一類長18～24個核苷酸的單鏈編碼RNA。它可通過與mRNA的3′UTR結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達〔4〕。已經(jīng)證實miRNA參與了肝損傷和肝衰竭的過程，例如大鼠熱缺血再灌注后肝損傷后循環(huán)miR-122的相對表達水平升高，血清miR-21水平升高和肝臟miR-223相對表達升高；miR-122的相對表達與血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性相關，可作為熱缺血再灌注后肝損傷的潛在標志物〔5〕。在乙酰氨基酚引起的急性肝衰竭模型中，microRNAs被動釋放到循環(huán)中；在miR-122、miR-192和miR-124-1顯著升高之前，總microRNA顯著升高，并與肝、腎和腦損傷的臨床證據(jù)密切相關〔6〕。尤其是一些特殊的miRNA可作為肝衰竭預后的生物學標志物，例如HBV-ACLF患者血清miR-125b-5p水平隨病情進展而升高，存活者血清miR-125b-5p水平低于死亡的HBV-ACLF患者；miR-125b-5p表達與總膽紅素和MELD評分呈正相關，與凝血酶原活性(PTA)呈負相關〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，在無ACLF和ACLF患者之間有20個miRNAs改變，與存活患者相比，在30 d內(nèi)死亡的患者中有27個miRNAs改變；通過驗證發(fā)現(xiàn)ACLF患者和30 d內(nèi)死亡的患者miR-223-3p和miR-25-3p表達的降低與ACLF的存在和預后不良有關〔8〕。因此，一些miRNAs可能在ACLF包括HBV-ACLF中有作為生物學標志物應用于臨床的潛力。通過微陣列分析技術，Zheng等〔9〕篩選出很多miRNAs，在HBV-ACLF患者的血清中9個miRNAs表達顯著上調(diào)(miR-21，miR-486-5p，miR-130a，miR-192，miR-148a，miR-143，miR-200a，miR-194，miR-122)。該研究證實恢復期ACLF患者血清miR-130a和miR-486-5p表達明顯高于未恢復期ACLF患者，血清miR-130a與國際標準化比值、凝血酶原時間(PT)、MELD呈負相關，與PTA呈正相關，提示miR-130a可能是HBV-ACLF患者有用的預后標志物。由于該研究沒有對miR-200a在HBV-ACLF中的表達進行進一步驗證，未深入探究其臨床相關性，本研究探討miR-200a在HBV-ACLF患者血清中的表達，并進一步探究其臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇臺州市椒江區(qū)婦幼保健院HBV-ACLF患者42例納入HBV-ACLF組，平均年齡(65.3±13.1)歲；無癥狀乙肝病毒攜帶者(ASC，30例納入ASC組，平均年齡(62.7±14.2)歲；慢性乙型肝炎(CHB)患者30例納入CHB組，平均年齡(64.5±12.9)歲?；颊呷朐汉笫占举Y料，各指標檢查由醫(yī)院檢驗科完成，ASC、CHB和HBV-ACLF的診斷依據(jù)慢性乙型肝炎防治指南(2015版)〔10〕和肝衰竭診治指南(2012年版)〔11〕。

1.2實驗試劑和設備 患者所做各項實驗室指標檢查的試劑和儀器由美國貝克曼庫爾特有限公司提供，TRIzolTMLS Reagent 試劑盒SYBR Green Ⅱ熒光染料(Invitrogen公司，美國)、Revert Aid First Stand cDNA synthesis kit試劑盒、酶標儀(MultiskanTMFC，Thermo Fishers公司，美國)、ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)。

1.3各組血清miR-200a表達的檢測 患者入院第2天清晨空腹采靜脈血，在室溫下靜置30 min后，1 500 r/min離心20 min分離血清，留存血清于-80℃待檢測。采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測各組血清miR-200a表達；并分析血清中miR-200a表達水平與HBV-ACLF預后的關系。

1.4qPCR檢測方法 使用TRIzolTMLS Reagent試劑盒提取血清中總RNA。根據(jù)沉淀量加入20 μl高溫滅菌去離子水溶解RNA，并使用酶標儀測定RNA的純度(260/280)及濃度。根據(jù)測得的RNA濃度，使用Revert Aid First Stand cDNA synthesis kit試劑盒和1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應結(jié)束后，加入180 μl去離子水稀釋逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)說明書，使用SYBR Green Ⅱ熒光染料(Invitrogen) 及ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems)檢測miR-200a的表達。以U6 snRNA的相對表達量為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt相對定量法進行統(tǒng)計分析。引物序列為：miR-200a，正義鏈：5′-TAACACTGTCTGGTAACGATG-T，反義鏈：5′-CATCTTACCGGACAGTGCTGGA；U6，正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t及χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組臨床資料比較 3組年齡、性別及HBV-DNA定量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組血小板計數(shù)(PLT)、總膽紅素(TBIL)、ALT、AST、MELD評分、PT和血清白蛋白(ALB)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

2.23組血清miR-200a表達的比較 與ASC組(0.61±0.31)和CHB組(0.86±0.45)相比，HBV-ACLF組(2.58±1.22)血清miR-200a表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學差異 (均P<0.001)。受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示miR-200a的表達對于區(qū)分HBV-ACLF和ASC或CHB價值明顯優(yōu)于區(qū)分ASC和CHB。見表2。

表2 3組血清miR-200a表達區(qū)分比較

2.3HBV-ACLF組生存患者與死亡患者血清miR-200a表達比較 13例死亡HBV-ACLF患者血清miR-200a 表達(3.66±1.06，n=13)明顯高于29例生存患者(2.10±0.96，n=29，P<0.001)。ROC曲線顯示miR-200a的表達對HBV-ACLF預后具有很好的預測價值(AUC=0.862，P<0.001)。

3 討 論

miRNA可穩(wěn)定表達于血液、血清等體液中，而且在不同疾病中表達譜不同，因而循環(huán)miRNA可作為潛在的生物學標志物用于疾病診斷和預后判斷。例如在急性心肌梗死后心力衰竭中，血清循環(huán)miR-150水平顯著降低，其表達水平與急性心肌梗死后心力衰竭獨立相關，血清循環(huán)miR-150是一種預測急性心肌梗死后心力衰竭新的生物標志物〔12〕。在胰腺癌中血清miR-1290和miR-1246表達上調(diào)，分別與腫瘤的分期和大小有關，且都是胰腺癌的獨立危險因素；血清miR-1290和miR-1246可能是胰腺癌診斷有潛在的生物標志物〔13〕?；顒有韵到y(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、非活動性SLE和健康對照組 miR-371b-5p和miR-5100的表達存在差異，且miR-371b-5p和miR-5100的表達水平與SLE患者的臨床參數(shù)之間存在相關性，提示miR-371b-5p和miR-5100可能是SLE的血清標志物。在HBV-ACLF中，凋亡、壞死的肝細胞可將細胞內(nèi)合成的miRNA釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中〔14，15〕，因此，血液中異常表達的miRNA也可作為診斷HBV-ACLF和評價預后的潛在生物學標志物。本研究結(jié)果表明，miR-200a不僅是肝脂肪變性的一個階段依賴性生物標志物，而且是人類免疫缺陷病毒(HIV)患者脂肪變性進展和肝細胞損傷的預測因子〔16〕。同時也有研究者發(fā)現(xiàn)miR-200a可作為ART治療的HIV-1感染者致命肝病的生物標志物〔17〕?？梢妋iR-200a在肝細胞損傷中發(fā)揮了重要作用，然而在HBV-ACLF并沒有miR-200a相關研究。本研究結(jié)果可能是由于ASC、CHB和HBV-ACLF患者不同的肝細胞損傷程度，且HBV-ACLF往往伴隨非常嚴重的肝細胞壞死。