多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化金銀花枝葉的提取工藝研究

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、消炎消腫、防癌抗癌、涼血止痢等醫(yī)療與保健功能[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸和異綠原酸以葉中的含量較高，而枝中咖啡酸含量高，不同時(shí)期的金銀花修剪枝的各部位均含有黃酮，且都是節(jié)部和葉片含量最高，花中次之，莖含量較低。金銀花枝葉中綠原酸和咖啡酸具有抗菌、抗病毒作用[2]。相比金銀花，其枝葉的藥用資源更為豐富，成本更為低廉。本實(shí)驗(yàn)希望明確金銀花枝葉的提取工藝，有利于進(jìn)一步研究其藥理作用以及抗菌抑菌活性，為其合理利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器：島津LC-20A vp高效液相色譜儀(日本島津)；島津 SPD-10A UV檢測(cè)器（日本島津）；METELLER電子分析天平(瑞士梅特勒)。UV-245紫外分光光度計(jì)（日本島津）；METELLER電子分析天平(瑞士梅特勒)。

1.2 試劑：綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15082402，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15092503，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制）；乙腈為色譜純，水為去離子水；其余均為分析純或藥用規(guī)格。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)：將綠原酸和總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)上述兩種成分的影響情況，從而進(jìn)一步開(kāi)展金銀花枝葉的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化金銀花枝葉提取工藝研究：在提取方法比較試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用回流法作為其最佳提取方法，考察乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等4個(gè)因素，每因素取3個(gè)水平，作L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3 綠原酸含量測(cè)定：分述如下。

2.3.1 色譜條件：資生堂Capcell Pak C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備：取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色瓶中，加50%甲醇制成每1ml含47μg的溶液，即得。

2.4 總黃酮含量測(cè)定：分述如下。

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10mg置50ml容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至50ml，制備濃度為0.2mg/ml的溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取上述溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml于10ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉和10%硝酸鋁各0.3ml，搖勻，放置6min，分別加入4%氫氧化鈉4ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置12min，在510nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)(y），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.0102x+0.0121，其中x為蘆丁濃度，單位為mg/L，y為吸光度，R2=0.9989。

2.4.3 測(cè)定法：分別精密吸取上述不同液料比提取液各0.5ml至10ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉和10%硝酸鋁各0.3ml，搖勻，放置6min，分別加入4%氫氧化鈉4ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置12min，在510nm處測(cè)定吸光度值。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化金銀花枝葉提取工藝：分別取金銀花枝葉（粉碎過(guò)三號(hào)篩）1g，精密稱(chēng)定，按照上述L9(34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，提取結(jié)束后，放冷，過(guò)濾，濾液分別用相應(yīng)的乙醇溶液定容至100ml，備用，每個(gè)濃度各重復(fù)3次（n=3）。以綠原酸含量、總黃酮含量為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法，并以綠原酸含量最高為50分，依次類(lèi)推；以總黃酮含量最高為50分，依次類(lèi)推。通過(guò)正交試驗(yàn)表統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳工藝。

3 結(jié)果

3.1 不同乙醇濃度對(duì)綠原酸、總黃酮含量的影響：取金銀花枝葉5份（粉碎過(guò)三號(hào)篩），分別精密稱(chēng)取1g，按液料比14∶1分別加入乙醇濃度為25%、40%、55%、70%、85%的乙醇溶液，各提取2次，每次1.5h，提取結(jié)束后，放冷，過(guò)濾，濾液分別用25%、40%、55%、70%、85%的乙醇定容至100ml，備用，每個(gè)濃度各重復(fù)3次（n=3）。精密吸取2.3.2項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品溶液，不同乙醇濃度供試品溶液各5μl，注入液相色譜中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)定綠原酸含量?？傸S酮按照2.4.3項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)綠原酸和總黃酮含量的影響

3.2 不同液料比對(duì)綠原酸、總黃酮含量的影響：取金銀花枝葉5份（粉碎過(guò)三號(hào)篩），分別精密稱(chēng)取1g，按液料比6：1、10：1、14：1、18：1分別加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液，各提取2次，每次1.5h，提取結(jié)束后，放冷，過(guò)濾，濾液分別用70%的乙醇定容至100ml，備用，每個(gè)液料比各重復(fù)3次（n=3）。精密吸取2.3.2項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品溶液，不同液料比供試品溶液各5μl，注入液相色譜中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)定綠原酸含量?？傸S酮按照2.4.3項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)綠原酸和總黃酮含量的影響

3.3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸、總黃酮含量的影響：取金銀花枝葉5份（粉碎過(guò)三號(hào)篩），分別精密稱(chēng)取1g，按液料比14：1分別加入濃度為70%的乙醇溶液，分別提取2次，每次0.5、1.0、1.5、2.0h，提取結(jié)束后，放冷，過(guò)濾，濾液分別用70%的乙醇定容至100ml，備用，每個(gè)不同提取時(shí)間各重復(fù)3次（n=3）。精密吸取2.3.2項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品溶液，不同提取時(shí)間供試品溶液各5μl，注入液相色譜中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)定綠原酸含量?？傸S酮按照2.4.3項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸和總黃酮含量的影響

3.4 提取次數(shù)對(duì)綠原酸、總黃酮含量的影響：取金銀花枝葉5份（粉碎過(guò)三號(hào)篩），分別精密稱(chēng)取1g，按液料比14：1分別加入濃度為70%的乙醇溶液，分別提取1、2、3、4次，每次1.5h，提取結(jié)束后，放冷，過(guò)濾，濾液分別用70%的乙醇定容至100ml，備用，每個(gè)不同提取次數(shù)試驗(yàn)各重復(fù)3次（n=3），精密吸取2.3.2項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品溶液，不同提取時(shí)間供試品溶液各5μl，注入液相色譜中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)定綠原酸含量?？傸S酮按照2.4.3項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)綠原酸和總黃酮含量的影響

3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果：由極差分析、方差分析結(jié)果顯示：因素影響乙醇濃度＞液料比＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)。最終確定最佳提取工藝為按液料比14：1加入70%濃度的乙醇溶液，分2次提取，每次提取1.5h。按照正交試驗(yàn)優(yōu)化所得最佳提取工藝，重復(fù)3次作為驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綠原酸含量分別為2.09%、2.11%、2.08%；總黃酮含量分別為8.02%、8.06%、8.05%，高于正交試驗(yàn)中的綠原酸和總黃酮含量，證明此方法確實(shí)可行。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)是在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定正交試驗(yàn)條件，再進(jìn)一步明確金銀花枝葉提取工藝。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的提高，金銀花枝葉中綠原酸的提取量和總黃酮提取率均顯著增加，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)70%時(shí)，二者均降低，這可能是過(guò)高的有機(jī)溶劑濃度導(dǎo)致細(xì)胞膜變性，通透性降低，阻礙了綠原酸的溶出，同時(shí)高濃度的乙醇限制了某些黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出。當(dāng)液料比大于14：1時(shí)，綠原酸提取量反而呈下降趨勢(shì)，總黃酮的提取率基本沒(méi)什么變化，考慮到溶劑用量及下一步濃縮工藝的負(fù)荷，選擇14：1比較合理。綠原酸的提取量和總黃酮提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)相應(yīng)增加，在1.5h左右，綠原酸的提取量趨于平衡，可能因?yàn)闀r(shí)間的過(guò)度延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)成分的溶解也隨之增加；總黃酮提取率反而有所下降，可能由于黃酮長(zhǎng)時(shí)間暴露，部分被氧化。隨著提取次數(shù)的增加，綠原酸的含量有所增加，但當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)2次后增加不是很明顯；總黃酮含量2次提取量比1次略高，但和3次、4次比較沒(méi)差異，考慮能耗和提取效率，選擇2次比較合理。