益氣養(yǎng)陰方含藥血清聯(lián)合化療藥對(duì)KG1α細(xì)胞活性的影響*

周琦浩 寧方穎 李雙雙

1 浙江省人民醫(yī)院望江山院區(qū) 浙江 杭州 310024

2 浙江省人民醫(yī)院 浙江 杭州 310014

3 浙江省腫瘤分子診斷與個(gè)體化治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310014

本研究選取單純的益氣養(yǎng)陰中藥（黃芪、太子參、女貞子、旱蓮草、麥冬），制備大鼠含藥血清，聯(lián)合化療藥（阿糖胞苷、喜樹堿、紫杉醇），共同作用于人白血病細(xì)胞系KG1α細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡、細(xì)胞周期等。探討益氣養(yǎng)陰方聯(lián)合化療藥對(duì)KG1α細(xì)胞活性的影響和機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株：采用8周齡、清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體重200g±20g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。KG1α細(xì)胞株購于BNCC細(xì)胞庫。

1.2 藥物及試劑：中藥材由杭州華東醫(yī)藥有限公司提供。喜樹堿、阿糖胞苷、紫杉醇：Aladdin公司。GAPDH抗體：CST公司；CD44、P21、survivin、SDF-1：abcam公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備及劑量：益氣養(yǎng)陰方：黃芪、太子參各30g，女貞子21g，旱蓮草18g，麥冬15g。藥液煎煮按照常規(guī)水提法進(jìn)行：即煎煮前先用涼水浸泡30min，煎煮2次。濃縮至1.14g/ml，冷卻分裝，4℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)“動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表”來計(jì)算大鼠灌胃中藥的劑量。對(duì)照組給予等量生理鹽水。

2.2 含藥血清的制備：將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和含藥血清組，分2次給灌胃（9∶00am、3∶00pm），灌胃7天。末次給藥2h后，大鼠稱重，按3.8ml/kg的量用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血前應(yīng)探明心臟搏動(dòng)最強(qiáng)部位，通常在胸骨左緣正中，選心跳最明顯的部位作穿刺。滅活。-20℃冷凍保存?zhèn)溆茫?個(gè)月內(nèi)用完。若是4℃保存，1周內(nèi)用完。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)：KG1α細(xì)胞的培養(yǎng)條件：含10%FBS的IMDM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力：取正常培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞鋪96孔板。含藥血清分為：5%、10%、15%、20%4個(gè)濃度血清，化療藥物作用濃度：阿糖胞苷 160μg/ml，喜樹堿0.1μg/ml，紫杉醇 50μg/ml。設(shè)置組別為：空白對(duì)照組，空白血清對(duì)照組，單獨(dú)含藥血清組，單獨(dú)化療藥組，含藥血清聯(lián)合化療藥組。藥物作用細(xì)胞0h、12h、24h、48h、72h。每孔加入10μl CCK8檢測(cè)液的工作液，37℃避光反應(yīng)2h，450nm處讀取各孔OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按下式計(jì)算：細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

2.5 流式檢測(cè)凋亡：細(xì)胞鋪6孔板，加入藥物處理后分別于12h、24h、48h后收集細(xì)胞樣本進(jìn)行凋亡檢測(cè)。收集細(xì)胞重懸，加入5μl的Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15min，加5μl的PI混勻后，室溫避光孵育5min；加200μl的1×Binding Buffer流式上機(jī)檢測(cè)。

2.6 流式檢測(cè)細(xì)胞周期：細(xì)胞鋪板，換成無血清的培養(yǎng)基同步化24h；加入藥物處理后分別于12h、24h、48h后收集細(xì)胞樣本進(jìn)行周期檢測(cè)。收集細(xì)胞，無水乙醇固定好的細(xì)胞，水化，離心收集，PBS清洗，加入1ml的 Reagent A溶液，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育30min。流式上機(jī)檢測(cè)。

2.7 WB檢測(cè)蛋白：細(xì)胞鋪板，加入不同藥物和含藥血清處理，藥物作用48h。制備蛋白樣品，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL化學(xué)發(fā)光顯影。導(dǎo)出照片后在Image J軟件下分析各條帶光密度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力結(jié)果：①含藥血清對(duì)KG1α細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，12h最為明顯，抑制作用隨著時(shí)間推移而減弱，這可能與血清衰老相關(guān)；以15%抑制作用最為明顯（圖1）。②阿糖胞苷對(duì)于KG1α細(xì)胞的抑制效果不明顯，直到在72h才開始出現(xiàn)輕度抑制細(xì)胞增殖（增殖率86.6%±1.1%），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但在含藥血清的作用下，阿糖胞苷對(duì)細(xì)胞的抑制明顯增加，從作用12h-5%的含藥血清開始抑制明顯（72.4%±8.3%），48h-15%含藥血清最為明顯（65.3%±4.1%），相比于對(duì)照組以及同時(shí)間點(diǎn)同濃度的阿糖胞苷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③喜樹堿在與細(xì)胞作用12h出現(xiàn)抑制效果(15%空白血清77.9%±2.6%)，并隨著時(shí)間增加而增加；在含藥血清的作用下，抑制更明顯（48h15%空白血清58.1±2.9%VS含藥血清27.1%±3.8%），對(duì)于空白組和同時(shí)間同濃度的單用喜樹堿組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④紫杉醇對(duì)于細(xì)胞的抑制率不明顯，在72h出現(xiàn)一部分的抑制率（72h15%空白血清68.1%±0.2%）；但在含藥血清作用下，12h即出現(xiàn)明顯抑制（12h15%空白血清85.9%±6.4%VS含藥血清53.6%±1.8%），相比于空白組和同濃度血清組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因15%含藥血清效果較為明顯，后面的實(shí)驗(yàn)濃度采用血清濃度為15%，因72h細(xì)胞老化比較明顯，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再加入。

圖1 不同濃度時(shí)間的含藥血清的KG1α細(xì)胞增殖抑制率

3.2 凋亡結(jié)果：在15%濃度血清下，12h、24h細(xì)胞凋亡并不明顯，48h各組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡（圖2）。空白血清+化療藥組，各組凋亡情況差異不大；但化療藥聯(lián)合含藥血清48h后，阿糖胞苷、紫杉醇比空白血清化療藥組的細(xì)胞凋亡更加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的凋亡情況

3.3 細(xì)胞周期結(jié)果：阿糖胞苷阻滯細(xì)胞在G1期，與對(duì)照組相比，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組+阿糖胞苷組G1期都延長(zhǎng)；紫杉醇能夠明顯阻滯細(xì)胞的G2/M期，與對(duì)照組相比，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)單用紫杉醇組G2/M期都延長(zhǎng)；喜樹堿阻滯細(xì)胞在S期和G2/M期，與對(duì)照組相比，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)單用喜樹堿組S期和G2/M期都延長(zhǎng)。且各給藥組48h均出現(xiàn)了不同程度的凋亡峰和碎片區(qū)。但含藥血清聯(lián)合化療藥組與對(duì)照組對(duì)細(xì)胞周期的影響差異不大。

3.4 WB結(jié)果：由WB顯示的蛋白變化（圖3）可以看出：阿糖胞苷能使細(xì)胞的CD44蛋白明顯下降，聯(lián)合含藥血清后使下調(diào)稍增加；喜樹堿能輕度增加CD44的表達(dá)，聯(lián)合含藥血清后表達(dá)更強(qiáng)；紫杉醇能使細(xì)胞的CD44表達(dá)稍下降，含藥血清組下降更為明顯。阿糖胞苷、喜樹堿使細(xì)胞的P21稍下調(diào)，聯(lián)合含藥血清組，下調(diào)進(jìn)一步增加；紫杉醇使細(xì)胞的P21下降明顯，含藥血清進(jìn)一步加強(qiáng)下調(diào)。阿糖胞苷能下調(diào)survivin表達(dá)，含藥血清稍加強(qiáng)此作用；喜樹堿、紫杉醇對(duì)survivin作用不明顯，紫杉醇聯(lián)合含藥血清能下調(diào)survivin表達(dá)。阿糖胞苷能明顯下調(diào)細(xì)胞SDF-1蛋白；喜樹堿對(duì)SDF-1變化不是很明顯；紫杉醇能下調(diào)SDF-1，含藥血清組加強(qiáng)此作用。

圖3 細(xì)胞的CD44、P21、suvivin、SDF-1蛋白表達(dá)情況

4 討論

目前，治療白血病的方式主要是采用聯(lián)合化療或骨髓移植。骨髓移植存在著配型難、移植物抗宿主病、復(fù)發(fā)等諸多問題，而化療藥對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的損傷也十分嚴(yán)重，并且許多患者易出現(xiàn)耐受。因此能找到增敏減毒有效的方法，抑制白細(xì)胞細(xì)胞增生誘導(dǎo)其凋亡、增加化療藥敏感性，將會(huì)開啟治療血液腫瘤的新篇章。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，中藥的抗腫瘤作用得到了更好研究和運(yùn)用。根據(jù)其臨床表現(xiàn)及發(fā)展特點(diǎn)，本病可歸為中醫(yī)學(xué)“虛勞”“癥瘕”等范疇。根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》“邪之所湊，其氣必虛”的理論，白血病的發(fā)生與體內(nèi)正氣不足、易感邪氣有關(guān)。但毒邪入侵一般不是馬上發(fā)病，有一個(gè)潛伏期，毒邪久戀，暗耗氣血，耗竭陰津，陰津虧虛，則氣無所依附，從而氣更虛。故益氣養(yǎng)陰法是中醫(yī)藥治療白血病的方法之一。在本研究中，用來制備含藥血清的益氣養(yǎng)陰方主要由益氣的黃芪、太子參，和養(yǎng)陰的女貞子、旱蓮草、麥冬組成，未加入清熱解毒等祛邪之類的攻藥，探討補(bǔ)法治療白血病的機(jī)制。

在本研究中，人白血病細(xì)胞系KG1α對(duì)160μg/ml濃度的阿糖胞苷、50μg/ml的紫杉醇并不是很敏感，在與細(xì)胞作用48h之前，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制、凋亡都不明顯，但聯(lián)合了含有益氣養(yǎng)陰方的大鼠血清后，白血病細(xì)胞的增殖抑制、凋亡都明顯增加。0.1μg/ml的喜樹堿對(duì)KG1α的抑制效果較明顯，含藥血清能進(jìn)一步增強(qiáng)抑制作用。但含藥血清的加入并未改變化療藥對(duì)細(xì)胞周期的影響。

CD44是細(xì)胞膜上廣泛分布的一種跨膜糖蛋白，屬于黏附分子。能與膠原、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)相互作用而參與血管的新生及腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、分化、遷移及浸潤(rùn)等過程。研究表明CD44高表達(dá)與造血系統(tǒng)惡性腫瘤病情進(jìn)展及預(yù)后不良密切相關(guān)[1]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病細(xì)胞KG1α的CD44表達(dá)，聯(lián)合益氣養(yǎng)陰中藥血清后，表達(dá)進(jìn)一步下降。紫杉醇能輕度降低CD44的表達(dá)，聯(lián)合含藥血清后，下降更明顯。喜樹堿對(duì)其變化不明顯。SDF-1又稱前B細(xì)胞刺激因子，屬于趨化因子CXC亞家族成員，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和不成熟的成骨細(xì)胞分泌，是包括造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的高效趨化因子。其配體有CXCR4和CXCR7等，SDF-1/CXCR4在Aml形成中發(fā)揮著重要作用，化療后CXCR4高表達(dá)提示預(yù)后不良[2]，CXCR7在正常人的骨髓、外周血、臍帶血中表達(dá)較低，但在白血病細(xì)胞高表達(dá)[3]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病細(xì)胞KG1α的SDF-1蛋白表達(dá)，因降低作用明顯，聯(lián)合益氣養(yǎng)陰中藥血清后蛋白并未進(jìn)一步下降。紫杉醇能輕度降低SDF-1的表達(dá)，聯(lián)合含藥血清后，下降更明顯。喜樹堿對(duì)其變化不明顯。P21是細(xì)胞周期蛋白，可以抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用。本研究中阿糖胞苷、喜樹堿能輕度下降P21蛋白表達(dá)，紫杉醇能較明顯地降低其表達(dá)，聯(lián)合含藥血清后下降更明顯。但是流式細(xì)胞檢測(cè)，聯(lián)合含藥細(xì)胞周期變化不明顯。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，參與細(xì)胞凋亡。

在本研究中可以觀察到益氣養(yǎng)陰含藥血清對(duì)白血病細(xì)胞KG1α體外的抑制作用，使對(duì)阿糖胞苷、紫杉醇不敏感的KG1α細(xì)胞在12h即出現(xiàn)增殖被抑制的效果，并且細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加。本實(shí)驗(yàn)的含藥血清中雖無“祛邪”的成分，但其“益氣養(yǎng)陰”的作用使KG1α細(xì)胞發(fā)生了改變，對(duì)化療藥更為敏感，細(xì)胞增殖抑制、凋亡都進(jìn)一步加強(qiáng)，這可能與CD44、SDF-1等蛋白表達(dá)改變相關(guān)。血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多種蛋白和細(xì)胞因子參與其調(diào)控的，其具體機(jī)制有待更深入的研究。