石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠腸道菌群的影響*

林路寧 姬麗婷 傅云波 林益游 石堅宏 張葉慧 楊元宵 李昌煜#

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

2 杭州醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種以進行性記憶減退、認知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制尚未明確。近年來，越來越多的研究表明，腸道菌群通過“腸-腦”軸發(fā)揮對人體的調(diào)節(jié)作用，腸道菌群通過人體營養(yǎng)物質(zhì)加工與吸收、炎癥與免疫反應(yīng)和神經(jīng)遞質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運等作用影響AD[1-2]。同時，眾多研究證明中藥及其活性成分可以選擇性促進益生菌或抑制致病菌的生長，從而改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能，進而影響宿主[3]。石菖蒲為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）的干燥根莖，性溫，味辛、苦，歸心、胃經(jīng)，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲可以有效改善東莨菪堿所致的學習記憶障礙模型大鼠的學習記憶能力[4]，但是石菖蒲對腸道菌群的影響尚不清楚。本研究擬通過Morris水迷宮實驗檢測石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠學習記憶能力的影響，并運用16S rRNA測序技術(shù)探討石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠腸道菌群的影響。

1 實驗材料

1.1 試劑與儀器：石菖蒲飲片（浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，批號180601）；E.Z.N.ATMMag-Bind soil DNA Kit（OMEGA，貨號M5635-02）；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life，貨號Q10212）；2xTaq Master Mix（Vazyme，貨號P111-03）；MagicPure Size Selection DNA Beads（Transgen，貨號EC401-03）；Illumina MiSeq 測序儀（美國Illumina公司）；旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，GL-88B）；均勻型干式恒溫器（深圳拓能達科技有限公司，TND03-H-H）；Qubit2.0熒光儀（Invitrogen，Q32866）；熱循環(huán) PCR儀（BIO-RAD，T100TMThermal Cyeler）。

1.2 實驗動物：實驗選用雄性5月齡APPswe/tauP301L/PS1M146V（3xTg-AD）小鼠和同窩生野生型C57BL/6J對照小鼠。3xTg-AD小鼠和野生型C57BL/6J小鼠均購自美國Jackson實驗室，并由自主繁育純化得到，質(zhì)量合格證編號為SCXK（蘇）2018-0008。所有動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF屏障環(huán)境中，室溫維持在20～25℃，相對濕度40%～60%，每日光照12小時，可自由攝食、飲水。本研究方案經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準，決議編號為ZSLL-2018-17。

2 實驗方法

2.1 石菖蒲水提物的制備：石菖蒲飲片用10倍體積的蒸餾水浸泡2小時，回流煮沸半小時，過濾。重復(fù)提取2次后，合并濾液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥量1.6g/ml，保存在4℃冰箱中備用，使用時用蒸餾水稀釋至所需濃度。

2.2 動物分組及給藥：通過Morris水迷宮篩選沒有行為學差異的雄性5月齡3xTg-AD小鼠20只，隨機分為3xTg-AD組（M）、石菖蒲水提物4g/kg組（D）、石菖蒲水提物8g/kg組（Z）和石菖蒲水提物16g/kg組（G），每組5只；4只同窩同月齡的雄性野生型C57BL/6J小鼠設(shè)為野生對照組（W）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，石菖蒲水提物組小鼠分別按照 4g/（kg·d）、8g/（kg·d）和 16g/（kg·d）劑量以0.1ml/10g灌胃體積連續(xù)灌胃給藥4個月，野生對照組和3xTg-AD組小鼠灌胃等量的蒸餾水。

2.3 Morris水迷宮實驗：給藥4個月后，對所有小鼠進行Morris水迷宮實驗檢測其學習記憶能力。在第1～5天，將小鼠隨機從一個象限面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺的時間，記為逃避潛伏期，每個象限重復(fù)一次。若小鼠在60s內(nèi)未能找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺并保持15s。在第6天，將平臺移走，讓小鼠自由搜尋60s，記錄小鼠在60s內(nèi)進入原平臺象限的次數(shù)與平臺象限停留時間所占百分比數(shù)。

2.4 盲腸和結(jié)腸菌群分析：將野生對照組、3xTg-AD組和石菖蒲水提物16g/kg組小鼠麻醉后，迅速剖開腹部，取出盲腸和結(jié)腸中的內(nèi)容物，放入凍存管中，保存在-80℃。用E.Z.N.ATMMag-Bind soil DNA Kit提取樣品中的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的數(shù)量和質(zhì)量，采用16S rRNA基因的V3-V4區(qū)引物對基因組進行測序，引物的序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用cutadapt軟件去除序列接頭，pear軟件進行序列對拼，Prinseq軟件對序列進行質(zhì)量控制，Usearch軟件去除嵌合體及非特異性擴增序列，最終得到有效序列。然后用Usearch軟件在有效序列97%水平上進行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，并使用RDP classifier軟件對其進行物種分類，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息。使用R軟件中的“Vegan”數(shù)據(jù)包進行alpha多樣性指數(shù)計算。對各樣品菌群之間進行基于UniFrac距離的非加權(quán)（Unweighted）的主坐標分析（PCoA）。利用軟件PICRUSTs進行功能基因的預(yù)測和相關(guān)統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學方法：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布則采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊則采用LSD檢驗，若方差不齊則采用Games-Howell（A）檢驗；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為極顯著差異，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

3 實驗結(jié)果

3.1 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠學習記憶能力的影響：Morris水迷宮實驗結(jié)果如表1所示。與野生對照組小鼠比較，3xTg-AD組小鼠從第二天開始逃避潛伏期顯著增加（P＜0.01），撤離平臺之后平臺象限時間占比和穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.01，P＜0.01）；與3xTg-AD組小鼠比較，石菖蒲水提物16g/kg組小鼠從第四天開始逃避潛伏期顯著減少（P＜0.01），撤離平臺后平臺象限占比和穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），而另外兩個劑量組沒有顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果說明石菖蒲水提物16g/kg可以顯著提高3xTg-AD小鼠的學習記憶能力。

表1 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠逃避潛伏期、平臺象限占比和穿越平臺次數(shù)的影響（±s）

表1 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠逃避潛伏期、平臺象限占比和穿越平臺次數(shù)的影響（±s）

注：W：野生對照組（n=4），M：3xTg-AD組（n=5），D：石菖蒲水提物4g/kg組（n=5），Z：石菖蒲水提物8k/kg組（n=5），G：石菖蒲水提物16g/kg組（n=5）。與W組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與M組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

穿越平臺次數(shù)（次）12.3±1.3 6.0±3.3**7.8±2.2 8.5±1.9 11.0±2.4▲▲組別W組M組D組Z組G組逃避潛伏期（s）第一天16.2±6.6 25.2±8.5 27.7±7.6 25.3±9.7 27.9±11.6第二天12.0±5.9 26.8±9.2**26.4±12.4 29.0±9.4 22.5±12.5第三天6.6±2.7 20.3±8.7*20.8±10.3 17.6±6.1 14.5±6.0第四天10.5±4.0 18.3±2.0**15.6±4.1 13.8±2.7 9.0±2.2▲▲第五天8.4±3.6 15.9±4.0*14.3±6.7 12.9±7.0 8.5±2.5▲平臺象限占比（%）47.5±6.5 28.7±5.0**33.4±2.3 32.8±2.0 38.3±5.0▲

3.2 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸菌群的影響：分述如下。

3.2.1 對小鼠盲腸和結(jié)腸菌群alpha多樣性指數(shù)的影響：Chao與Ace指數(shù)代表了物種總數(shù)，Shannon和Simpson指數(shù)代表了物種多樣性。結(jié)果如表2所示，與野生對照組比較，3xTg-AD組小鼠盲腸和結(jié)腸菌群中的Chao和Ace豐富度指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），與3xTg-AD組相比，石菖蒲水提物16g/kg組小鼠盲腸菌群中的Chao和Ace豐富度指數(shù)顯著降低（P＜0.05），但各組小鼠之間的Shannon和Simpson指數(shù)沒有顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸的菌群物種豐富度高于野生型小鼠，且石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸菌群的物種豐富度具有調(diào)節(jié)作用，但對物種多樣性無顯著作用。

表2 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸菌群的alpha多樣性指數(shù)的影響（±s）

表2 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸菌群的alpha多樣性指數(shù)的影響（±s）

部位盲腸結(jié)腸Simpson指數(shù)0.06±0.04 0.04±0.02 0.06±0.02 0.09±0.07 0.05±0.02 0.07±0.03組別W組M組G組W組M組G組Chao指數(shù)832.0±67.21 1026.2±92.3*873.4± 95.8▲766.1±89.9 978.6±149.9*901.8±109.7 Ace指數(shù)928.0±177.9 1230.7±129.5*993.8±489.7▲837.7±16.7 1174.4±168.4*1151.6±213.0 Shannon指數(shù)4.1±0.5 4.3±0.4 4.0±0.3 3.4±1.0 4.1±0.3 3.8±0.3

3.2.2 對小鼠盲腸和結(jié)腸菌群beta多樣性指數(shù)的影響：對所有樣本進行主坐標分析（PCoA），圖中樣本之間距離越接近，表明該樣本的物種組成越相似?；趗nweighted UniFrac的PCoA分析結(jié)果顯示，在盲腸（圖1a）和結(jié)腸（圖1b）菌群中，3xTg-AD組和石菖蒲組小鼠之間的距離均較近但不重合，而野生對照組與它們明顯分離，這說明野生對照組與3xTg-AD組小鼠之間存在明顯差異，且石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸菌群均有影響。

圖1 3xTg-AD小鼠盲腸（a）和結(jié)腸（b）菌群基于unweighted UniFrac的PCoA分析

3.2.3 對小鼠盲腸和結(jié)腸菌群組成及結(jié)構(gòu)的影響：基于OTU的物種分類結(jié)果如圖2a和2b所示，結(jié)果分別顯示了各組小鼠盲腸和結(jié)腸菌群在門和屬水平上的相對豐度。在門水平上，與野生對照組比較，3xTg-AD組小鼠結(jié)腸菌群中Deferribacteres的相對豐度顯著升高（P＜0.01）。與3xTg-AD組比較，石菖蒲水提物組小鼠盲腸菌群中Actinobacteria的相對豐度顯著升高（P＜0.05），結(jié)腸菌群中Firmicutes的相對豐度顯著降低（P＜0.01），Bacteroidetes的相對豐度顯著升高（P＜0.05）以及Bacteroidetes/Firmicutes的比值顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

在屬水平上，與野生對照組比較，3xTg-AD組小鼠盲腸菌群中相對豐度顯著升高的菌屬有Clostridium XVIII、Olsenella、Bifidobacterium、Coprococcus、Turicibacter、Clostridium sensu stricto和Gemella，顯著降低的有Bacteroides和Butyricimonas；結(jié)腸菌群中相對豐度顯著升高的菌屬有Olsenella、Jeotgalicoccus、Mucispirillum、Clostridium XVIII、Bifidobacterium、Allobaculum、Marvinbryantia、Turicibacter、Helicobacter、Parasutterella和Gemella。與3xTg-AD組比較，石菖蒲水提物組小鼠盲腸菌群中相對豐度顯著升高的菌屬有Olsenella、Bifidobacterium、Parvibacter、Enterorhabdu和Desulfovibrio，顯著降低的有Bilophila和Turicibacter；結(jié)腸菌群中相對豐度顯著降低的有Sporobacter和Allobaculum。注：W：野生對照組（n=4），M：3xTg-AD組（n=5），G：石菖蒲水提物16g/kg組（n=5）。與W組比較，*P＜0.05；與M組比較，▲P＜0.05。

圖2 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸和結(jié)腸菌群在門（a）和屬（b）水平物種分布的影響

圖3 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠結(jié)腸菌群中Bacteroidetes/Firmicutes比值的影響

3.2.4 對小鼠盲腸和結(jié)腸菌群功能的影響：各組小鼠盲腸和結(jié)腸菌群KEGG通路功能的預(yù)測結(jié)果分別如圖4a和4b所示，石菖蒲主要改變了結(jié)腸菌群的功能。野生對照組和3xTg-AD組小鼠之間富集到了17條差異通路，其中在3xTg-AD組中有15條通路顯著上調(diào)，主要涉及能量代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸代謝、其他氨基酸的代謝異源生物的生物降解與代謝和膜運輸?shù)龋?條通路顯著下調(diào)，分別是脂質(zhì)生物合成蛋白和脂質(zhì)代謝。給予石菖蒲水提物后，61條通路發(fā)生了改變，其中46條通路顯著上調(diào)，主要涉及聚糖的生物合成和代謝、輔因子和維生素的代謝、氨基酸代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝等；15條通路顯著下調(diào)，主要涉及遺傳信息處理等。

圖4 石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠盲腸（a）和結(jié)腸（b）菌群功能的影響

4 討論

本實驗通過16S rRNA測序的方法研究石菖蒲水提物對3xTg-AD小鼠腸道菌群的影響。3xTg-AD小鼠是廣泛使用的AD動物模型之一，我們的實驗結(jié)果證明了3xTg-AD小鼠在9月齡時表現(xiàn)出明顯的學習記憶能力受損，而石菖蒲水提物在16g/kg劑量下對之具有顯著改善作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，3xTg-AD小鼠的盲腸和結(jié)腸菌群從門水平到屬水平均發(fā)生了變化，其腸道菌群確實存在一定程度的失調(diào)。在門水平上,3xTg-AD小鼠結(jié)腸菌群中Bacteroidetes/Firmicutes的比值降低，這與文獻報道一致，可能與低水平炎癥[5]和大腦代謝不足有關(guān)[6]；而石菖蒲水提物則顯著增加結(jié)腸菌群的Bacteroidetes/Firmicutes比值。因此我們推測，結(jié)腸菌群中Firmicutes的增加和Bacteroidetes的減少可能與石菖蒲水提物發(fā)揮AD干預(yù)作用相關(guān)。在屬水平上,3xTg-AD小鼠盲腸菌群中Turicibacter和結(jié)腸菌群中Allobaculum的豐度增加，石菖蒲水提物給藥后，二者豐度均顯著降低。Turicibacter會引起炎癥，并對腸道功能產(chǎn)生不良影響，還可能與神經(jīng)血管的完整有關(guān)。Allobaculum會增加腸黏膜屏障的通透性，導(dǎo)致細菌與腸道上皮的接觸更加緊密，使細菌及其代謝產(chǎn)物更加容易穿過腸道進入血液循環(huán)。石菖蒲給藥后，Turicibacter和Allobaculum的豐度均顯著下調(diào)，表明石菖蒲水提物可以改善3xTg-AD小鼠腸道菌群的失調(diào)。

基于KEGG通路的功能預(yù)測分析結(jié)果表明，石菖蒲水提物可能改變了結(jié)腸菌群的功能，主要涉及的通路大部分與氨基酸、維生素的代謝相關(guān)。石菖蒲水提物可能上調(diào)結(jié)腸菌群中葉酸的生物合成和維生素B6的代謝通路，而維生素B6缺乏會導(dǎo)致認知能力下降。同時，石菖蒲水提物還可能上調(diào)了結(jié)腸菌群中氨基酸代謝相關(guān)通路，例如色氨酸是5-羥色胺（5-HT）的前體，95%以上的5-HT在腸內(nèi)合成并在認知、學習和記憶過程中起著關(guān)鍵的作用。提示石菖蒲水提物改善學習記憶能力作用可能與調(diào)節(jié)腸道菌群功能有關(guān)。

綜上所述，石菖蒲水提物16g/kg能改善3xTg-AD小鼠的學習記憶能力，這一作用可能與其改善3xTg-AD小鼠腸道菌群失調(diào)有關(guān)，其具體機制尚需進一步研究。