雞胚來源的外泌體不同提取方法比較

李 瑩，瞿 浩，何靜怡，劉天飛，王 劼，王 艷，舒鼎銘，羅成龍

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】雞胚蛋是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后尚未破殼可食用的雞蛋［1］。早在明朝，《本草綱目》就有記載：“雞胚蛋有治頭痛、偏頭痛、頭瘋病及四肢瘋瘴之功能，童叟弱者常食之，有健脾胃作用，遂而起到強(qiáng)身健體之功效”。在孵化過程中，雞胚蛋提供了雛雞生長(zhǎng)發(fā)育所必需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，因此雞胚蛋被認(rèn)為是有生命力的蛋，民間有“喜蛋”“活珠子”“毛蛋”等俗稱［2］。雞胚蛋是民間食補(bǔ)佳品，在我國南方以及日本、韓國等東南亞國家一直有食用雞胚蛋的習(xí)俗［3-4］。與鮮雞蛋相比，雞胚蛋中對(duì)人體有利的物質(zhì)增加，如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、不飽和脂肪酸、?；撬峒懊庖咔虻鞍椎?，而總糖、總脂肪、膽固醇等不利物質(zhì)明顯下降［4-5］。雞胚混懸液或凍干粉可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗衰老等［6-10］，雞胚除常規(guī)的“喜蛋”“活珠子”產(chǎn)品外，雞胚保健食品、雞胚營養(yǎng)粉等新型雞胚制品也應(yīng)運(yùn)而生。雞胚蛋作為傳統(tǒng)的功能性食品，因其具有提高免疫力的功效而被廣泛食用，對(duì)其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制進(jìn)行科學(xué)研究與驗(yàn)證具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】外泌體（Exosomes）是一種由細(xì)胞分泌的胞外囊泡，于1983年在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone對(duì)其命名［11］。外泌體含有蛋白質(zhì)、非編碼RNA（miRNA、lncRNA等）、mRNA、脂質(zhì)等功能物質(zhì)，并在細(xì)胞間信息傳遞、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫調(diào)控、代謝物清除及凝血等方面發(fā)揮重要作用［12-13］。研究表明，外泌體所含小RNA，可以穩(wěn)定存在并推測(cè)能夠通過囊泡運(yùn)輸進(jìn)入目的細(xì)胞，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等［14］。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李學(xué)偉教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)乳汁外泌體內(nèi)的miRNA在高溫、酸性、凍融和外源RNA酶處理等條件下免受內(nèi)源性RNA酶的降解作用，以一種非常穩(wěn)定的狀態(tài)存在，由此推測(cè)外泌體miRNA可能通過乳汁的方式從消化道黏膜表皮細(xì)胞直接被子代攝入［15-16］。人食用牛乳4～6 h后血漿中檢測(cè)到高含量miR-29b和miR-200c（牛乳富含miRNAs），牛奶消耗后血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2, RUNX2，miR-29b的已知靶標(biāo)）的表達(dá)增加31%［17］；金銀花的MIR2911通過飲食方式傳遞至小鼠外周血和肺臟，并通過靶向聚合酶堿性蛋白2（Polymerase basic protein 2, PB2）和非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nonstructural protein 1, NS1）基因抑制甲型流感病毒的復(fù)制；生姜外泌體miRNAs可以調(diào)節(jié)腸道菌群改善腸道健康［19］。上述研究說明食物中外泌體的miRNAs可能是調(diào)節(jié)人類基因的食源性生物活性物質(zhì)。近年來，血液、唾液、尿液、乳汁、細(xì)胞培養(yǎng)液等液體樣本中的外泌體分離及功能得到深入研究，而組織樣本中外泌體的分離及功能研究報(bào)道鮮見?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】作為傳統(tǒng)的食補(bǔ)佳品，雞胚蛋中生物活性物質(zhì)的傳遞及其可能的作用機(jī)制尚不清楚，所含的外泌體及其攜帶的miRNAs對(duì)人類健康如何發(fā)揮作用值得我們探索，然而目前既無適用于動(dòng)物組織中外泌體分離純化的標(biāo)準(zhǔn)方法，也無適用的商業(yè)化試劑盒，阻礙了雞胚外泌體功能的深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以雞胚為素材，綜合采用樣品前處理、超速離心、液體樣本外泌體提取的商業(yè)化試劑盒分離雞胚組織來源的外泌體，比較各方法所獲外泌體含量與純度，為后續(xù)深入解析雞胚中活性物質(zhì)及其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所家禽試驗(yàn)場(chǎng)收集處于產(chǎn)蛋高峰期的惠陽胡須雞受精蛋30枚。于收集當(dāng)天置于數(shù)字孵化器中孵化，孵化條件為37 ℃、相對(duì)濕度65%～75%，每小時(shí)自動(dòng)翻蛋1次，孵化至13 d時(shí)，取出雞胚蛋終止孵化，選擇大小及重量相近的胚蛋12枚，分為3組，每組4枚，用于后續(xù)處理。

主要試劑：Ⅲ型膠原酶，美國Worthington Biochemical公司；無菌PBS、DMEM培養(yǎng)基、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自Thermo Scientific公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自Cell Signaling Technology公司；exoEasy Maxi kit試劑盒購自Qiagen公司；ExoQuick ULTRA EV Isolation kit試劑盒購自System Biosciences公司；流式檢測(cè)CD63-Antibody-FITC和CD81-Antibody-FITC，購自美國BD生物科學(xué)公司。

主要儀器：數(shù)字孵化器（Digital incubator Rcom PRO 50 PX-50），韓國Autoelex 有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；低溫離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific公司；超速離心機(jī)（XPN-100），美國Beckman Coulter有限公司；透射電鏡（JEM-1200EX），日本電子株式會(huì)社（JEOL）；納米流式檢測(cè)儀（Flow NanoAnalyzer，nanoFCM），廈門福流生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀（BD accuri C6 flow cytomenter），美國BD生物科學(xué)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚組織消化 用75%酒精擦拭胚蛋表面后置于超凈工作臺(tái)，用無菌鑷子從雞蛋鈍端開孔并取出雞胚，將分離到的雞胚經(jīng)無菌PBS漂洗2～3次，去除喙、翅、腳等。用滅菌的剪刀輕柔剪碎，并經(jīng)0.5% Ⅲ型膠原酶于37 ℃消化30 min，期間輕柔混勻消化液，收集消化樣品，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，并定容至50 mL，用于后續(xù)離心。

1.2.2 雞胚組織中外泌體分離 雞胚組織經(jīng)酶消化、差速離心、過濾等前處理后，分別采用超速離心法（UC）、蔗糖墊超速離心法（SDUC）、exoEasy Maxi kit膜 親 和 法（exoEasy） 以 及exoQuick ULTRA EV Isolation kit聚乙二醇沉淀法（exoQuick）4種方法進(jìn)行外泌體的分離、純化，操作流程如圖1所示，所獲樣品經(jīng)PBS重懸或洗脫液洗脫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后分裝，分別標(biāo)記為A、B、C和D，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 4種雞胚組織中外泌體分離提取方法流程Fig. 1 Four methods process for the isolation and extraction of exosomes from chicken embryo tissues

1.2.3 外泌體蛋白濃度測(cè)定 按照BCA試劑盒操作說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定A、B、C和D樣品蛋白濃度。取各稀釋濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白質(zhì)樣品各25 μL，加入微孔板中，然后加入200 μL工作液，并在振蕩器上震蕩30 s，充分混勻，將微孔板密封，在37 ℃孵育30 min，將微孔板冷卻到室溫，使用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在562 nm處的吸光值。

1.2.4 外泌體鑒定 采用透射電鏡觀察囊泡形態(tài)、大小，將制備好的外泌體樣品10 μL滴于2 mm載樣銅網(wǎng)上，沉淀3 min，用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸去浮液；經(jīng)PBS漂洗后用3%磷鎢酸負(fù)染；室溫干燥5 min，將載樣銅網(wǎng)置于電鏡樣品室，80 kV下觀察樣品形態(tài)并拍照。采用納米流式nanoFCM檢測(cè)囊泡大小分布及其囊泡顆粒濃度，該法利用二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)球建立散射光強(qiáng)度與顆粒粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，可將相同條件下待測(cè)樣品的散射強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為粒徑，獲得待測(cè)樣品的粒徑分布；通過檢測(cè)已標(biāo)定濃度的熒光微球的個(gè)數(shù)快讀得到特定進(jìn)樣壓力的樣品流體積流量，在相同的進(jìn)樣壓力條件下檢測(cè)待測(cè)樣品，獲得樣品的顆粒濃度，根據(jù)儀器操作說明參照粒徑標(biāo)準(zhǔn)品和已標(biāo)定濃度的熒光微球的適宜檢測(cè)條件對(duì)外泌體樣品進(jìn)行測(cè)定。外泌體標(biāo)記蛋白流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用100 μL無菌PBS復(fù)勻外泌體，密封冰上保存，樣品分別與含CD63和CD81抗體磁珠孵育、染色，并留取陰性對(duì)照，按照儀器操作進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚組織中外泌體蛋白濃度

采用BCA法對(duì)雞胚組織中外泌體進(jìn)行蛋白定量分析，得到A、B、C和D樣品的蛋白濃度分別為 274.56±18.19、94.81±10.74、793.86±28.81、1 301.28±180.26 μg/mL，由高到低依次為D＞C＞A＞B，不同方法獲得的外泌體蛋白濃度存在極顯著差異。聚乙二醇沉淀法獲得外泌體D，同時(shí)可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合沉淀，因此所獲外泌體中可能參雜其他雜蛋白，蛋白濃度最高。膜親合法獲得外泌體C，該方法運(yùn)用了囊泡的通用特性，可分離到所有類型的囊泡，因此C樣品蛋白濃度也較高。A、B分別為經(jīng)超速離心和蔗糖墊超速離心獲得的外泌體，前者沉淀了所有對(duì)應(yīng)離心力范圍的物質(zhì)，后者相對(duì)富集了30%蔗糖密度墊附近的囊泡顆粒，因此A樣品蛋白濃度較B樣品高。

2.2 雞胚組織中外泌體形態(tài)特征鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 在相同條件下利用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope, TEM）觀察4種方法分離獲得的樣品，均發(fā)現(xiàn)獲得呈圓形或橢圓形的囊泡顆粒，具有典型的杯狀，在囊泡外周可見膜性結(jié)構(gòu)（圖2），從微囊結(jié)構(gòu)、形態(tài)可判定樣品均為外泌體。各外泌體樣品囊泡顆粒大小、呈現(xiàn)狀態(tài)存在差異，A、B、C樣品在電鏡下均能看到大量具有外泌體樣結(jié)構(gòu)的囊泡，D樣品雖然也有一些外泌體樣結(jié)構(gòu)，但大部分出現(xiàn)聚團(tuán)，這可能與提取方法的特性有關(guān)。

圖2 透射電鏡檢測(cè)雞胚組織來源的外泌體Fig. 2 Embryo tissue-derived exosomes under TEM

2.2.2 粒徑分布及濃度檢測(cè) 根據(jù)nanoFCM測(cè)得的囊泡直徑分布（表1）可知，4種方法獲得的囊泡直徑范圍主要分布在50～145 nm之間，且直徑均值集中在70～80 nm范圍，其中C、D樣品直徑分布范圍寬，而B樣品直徑分布范圍最窄。4種方法獲得囊泡濃度由高到低依次為D＞C＞A＞B，與外泌體蛋白濃度變化趨勢(shì)一致。同時(shí)，傳統(tǒng)方法與商業(yè)化試劑盒分離到的囊泡數(shù)量存在極顯著差異。A、B均采用超速離心法，但B樣品為在30%蔗糖密度墊處富集的囊泡，囊泡顆粒濃度和種類均少于A樣品。此外，因雞胚組織由多種細(xì)胞組成，故分離到的囊泡異質(zhì)性特征明顯，大小、直徑均有差異。

表1 雞胚組織中胞外囊泡的納米流式檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of embryo tissue-derived extracellular vesicles under nanoFCM

圖3 雞胚組織中外泌體標(biāo)志蛋白的流式檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Detection results of embryo tissue-derived exosome marker proteins under flow cytometry

2.2.3 標(biāo)志蛋白鑒定 為進(jìn)一步確認(rèn)和比較分析所獲外泌體情況，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)外泌體標(biāo)志蛋白（CD63、CD81）熒光抗體孵育的外泌體樣品。由圖3可知，4個(gè)樣品中均檢測(cè)到一定比例的陽性囊泡顆粒，說明分離到的外泌體具有胞外囊泡標(biāo)志蛋白。本研究中CD63和CD81陽性比例存在差異，其中CD63陽性率為B（77.0%）＞D（71.7%）＞C（68.2%）＞A（16.3%），CD81陽性率為B（81.2%）＞D（79.0%）＞C（78.9%）＞A（48.6%），但兩者陽性率變化趨勢(shì)一致。從標(biāo)志蛋白陽性率來看，B方法分離獲得的外泌體純度最好。

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者采用不同的商業(yè)化試劑盒、超速離心等方法研究了各種液體樣本（血清、乳汁、細(xì)胞上清等）中的外泌體，僅從所獲外泌體的蛋白濃度、顆粒濃度指標(biāo)判定，商業(yè)化試劑盒普遍優(yōu)于超速離心法，且以聚乙二醇沉淀法開發(fā)的試劑盒分離產(chǎn)量最高［20-24］，因聚乙二醇沉淀法分離外泌體試劑盒出現(xiàn)早、應(yīng)用廣，有效解決了超速離心耗時(shí)長(zhǎng)及其對(duì)技術(shù)與平臺(tái)要求高的問題，因此相關(guān)研究報(bào)道最多。該方法具有快速、簡(jiǎn)單、易操作、樣本處理體積范圍廣的優(yōu)勢(shì)［25］，部分研究者從經(jīng)濟(jì)成本、蛋白產(chǎn)量和囊泡濃度指標(biāo)考量推薦使用基于聚乙二醇沉淀法開發(fā)的試劑盒，如ExoQuik試劑盒（System Bioscience公司）和Total Exosome Isolation Kit試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司）［21,25］。但是，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇沉淀法對(duì)各類囊泡均無選擇性，除了獲得外泌體外，同時(shí)還能獲得其他細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體等［26］?；谀びH和法分離外泌體的試劑盒具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，且可根據(jù)外泌體與雜質(zhì)有無膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分，因此樣本是否存在細(xì)胞和細(xì)胞碎片等有膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)是該方法成敗的關(guān)鍵。

組織內(nèi)細(xì)胞間外泌體在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但組織中外泌體分離、純化及其功能研究報(bào)道較少。鑒于目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的組織樣本外泌體分離方法，本研究采用Ⅲ型膠原酶消化、差速離心和過濾等進(jìn)行前處理，與前人采用的前處理方法不盡相同。對(duì)于富含外泌體的腦組織，Gallart-Palau等［27］采用機(jī)械均質(zhì)化和過濾進(jìn)行腦組織樣品前處理；Vella等［28］采用酶消化、離心進(jìn)行前處理；對(duì)于脂肪組織，Zhang等［29］采用離體培養(yǎng)3 d后通過收集培養(yǎng)液分離外泌體，該方法獲得了組織分離培養(yǎng)條件下所分泌的外泌體，組織細(xì)胞離體培養(yǎng)過程中可能會(huì)因環(huán)境的改變影響外泌體的釋放及其所攜帶的物質(zhì)成分。近期兩個(gè)不同研究團(tuán)隊(duì)先后報(bào)道了人腎癌組織和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中外泌體的分離與純化，在樣品前處理方面，均采用了膠原酶消化、離心、過濾，與本研究采用的前處理方法相似，在分離、純化方面采用超速超速離心或蔗糖梯度離心，與本試驗(yàn)UC和SDUC法基本一致，均采用 100 000～120 000 g的離心條件［30-31］。

由TEM、nanoFCM和流式細(xì)胞檢測(cè)可知，4種方法均可獲得具有典型形態(tài)特征的外泌體囊泡，囊泡形態(tài)、粒徑范圍及標(biāo)志蛋白與乳汁［32］、尿液［33］、血漿［34］、子宮腹水［35］及細(xì)胞培養(yǎng)液［36］中分離的外泌體特征基本一致。本研究中商業(yè)化試劑盒分離到的囊泡數(shù)量是超速離心法的10倍以上。Tang等［37］比較了超速離心法和兩種商業(yè)化試劑盒（exoQuick和TEI）分離提取細(xì)胞培養(yǎng)液和血清中外泌體的效果，Helwa等［34］分析了超速離心與miRCURY、exoQuick和TEI 3種商業(yè)化試劑盒提取血清外泌體的效果，均發(fā)現(xiàn)商業(yè)化試劑盒的外泌體顆粒濃度遠(yuǎn)高于超速離心，與本研究結(jié)果一致。然而聚乙二醇沉淀法分離的外泌體蛋白濃度最高且出現(xiàn)聚團(tuán)，說明分離到的樣品中含有大量其他物質(zhì)，這與Tang等［37］、Caradec等［21］分離血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等液體樣本外泌體的研究報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，不同分離方法獲得的外泌體樣品的標(biāo)志蛋白含量不同，這與Royo等［38］采用WB檢測(cè)不同方法獲得的尿液中外泌體樣品標(biāo)志蛋白（CD9、CD10、CD63、TSG101等）得到的結(jié)果相似；SDUC法分離到的外泌體標(biāo)志蛋白陽性率最佳，而Ding等［20］采用WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101發(fā)現(xiàn)，exoQuick分離的外泌體其標(biāo)記蛋白陽性率高于超速離心，與本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果不同，這可能與所采取的檢測(cè)方法及其抗體結(jié)合能力有關(guān)。

目前，外泌體純化產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，綜合比較發(fā)現(xiàn)，不同方法獲得的外泌體在蛋白濃度、囊泡顆粒濃度、直徑大小分布、RNA總量、小RNA表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜等方面均存在差異，尤其小RNA表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜差異較大［20,22,39］。不同研究團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)超速離心獲得的血漿外泌體樣品RNA含量及蛋白純度優(yōu)于商業(yè)化試劑盒［34,37］，且結(jié)合密度梯度純化獲得的樣品純度最高［22-23］，但產(chǎn)量遠(yuǎn)低于商業(yè)化試劑盒。針對(duì)各種商業(yè)化試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，基于膜親和法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液和血漿外泌體RNA純度高、質(zhì)量好［22］。分析外泌體樣本蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，商業(yè)化試劑盒中聚乙二醇沉淀法獲得較高的外泌體產(chǎn)量［20］，但含有大量非外泌體顆粒（如血清蛋白聚集體），因此外泌體純度很低［34］。

不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，超速離心法作為外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，仍是最常用的外泌體純化手段。同時(shí)，目前僅有的少量從組織中分離純化外泌體的報(bào)道均采用超速離心法，但超速離心法費(fèi)時(shí)、對(duì)設(shè)備要求高，在多個(gè)循環(huán)中施加不同的離心力，有助于去除細(xì)胞碎片和其他污染物，使外泌體樣本純度更好，但也存在可能導(dǎo)致樣本中的外泌體損失及外泌體產(chǎn)量更低等缺陷。目前尚無針對(duì)組織樣本外泌體分離純化的商業(yè)化試劑盒，現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒均為針對(duì)液體樣本，其操作簡(jiǎn)單、高效，但試劑盒之間差異大，每種方法都不能有效分離到高純度的外泌體，不同方法獲得的外泌體中存在白蛋白、高密度脂蛋白和RNA結(jié)合蛋白（Argonaute 1和2）聚集體等污染，而這一比例的大小尚無確切數(shù)據(jù)支撐，需要進(jìn)一步鑒定［22,24］。因此，需根據(jù)試驗(yàn)材料、目的以及后續(xù)研究需要綜合評(píng)估選用適宜的分離純化方法，在得率與純度之間取得良好平衡。本研究在前處理的基礎(chǔ)上利用超速離心、蔗糖墊超速離心和商業(yè)化試劑盒進(jìn)行了組織中外泌體的分離比較，為后續(xù)開展組織中外泌體分離及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究比較了超速離心法、蔗糖墊超速離心法、膜親和法以及聚乙二醇沉淀法分離雞胚組織中外泌體的效果，綜合考量外泌體的純度、形態(tài)、大小及其標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況，根據(jù)供試組織樣品來源、試驗(yàn)條件和目的可優(yōu)選蔗糖墊超速離心法或膜親和法，如需高純度外泌體可首選蔗糖墊超速離心法（SDUC），樣品稀有或不具備超速離心設(shè)備則選用膜親和法（exoEasy）。