超臨界CO2 對哈密瓜汁中大腸桿菌的殺滅效果研究

侯思涵，陳計巒，裴龍英，李文新

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

新疆是哈密瓜主要種植區(qū)。由于產(chǎn)區(qū)多分布在南北疆，遠離內(nèi)地市場，鮮瓜運輸和貯藏期間損耗很大，每年因腐爛變質(zhì)造成的損失達到25%～30%。因此，亟需開發(fā)哈密瓜保值增值技術，其中哈密瓜汁飲料是最具潛力的哈密瓜加工產(chǎn)品。哈密瓜是熱敏性水果，在熱殺菌過程中會產(chǎn)生大量的熱臭異味，嚴重影響了哈密瓜汁的正常風味，哈密瓜在國際上還沒有成為果汁工業(yè)化生產(chǎn)的主要原料。因此，采用新型殺菌方法最大程度地保持哈密瓜汁原有風味便成為哈密瓜汁加工生產(chǎn)中急需解決的問題。

超臨界二氧化碳（SCCO2）是廉價無毒的天然殺菌劑，能有效的殺滅微生物[1-5]，是一項綠色環(huán)保的非熱力殺菌技術。超臨界CO2技術不僅能有效殺滅食品中的腐敗微生物和病原微生物，還能保持食品的色澤、風味和營養(yǎng)成分，克服熱力殺菌造成的營養(yǎng)成分損失和熱臭氣味的產(chǎn)生。近年來，國內(nèi)外利用超臨界二氧化碳對果蔬進行滅菌已有文獻報道，但對哈密瓜汁采用超臨界CO2技術進行殺菌的報道極少[6]。

本試驗采用超臨界CO2對哈密瓜汁進行處理，以哈密瓜汁中大腸桿菌為研究對象，研究超臨界CO2對哈密瓜汁中大腸桿菌的殺滅效果，結合細胞超微結構的觀察和分析，探討超臨界CO2的殺菌機理，為哈密瓜汁等果蔬汁加工及超臨界CO2的產(chǎn)業(yè)化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

哈密瓜：購于石河子農(nóng)貿(mào)市場，新鮮飽滿，成熟度均勻，可溶性固形物含量9%～11%。

哈密瓜汁：哈密瓜清理，去皮，去籽，切成2～3 cm的小塊，榨汁后用4 層紗布過濾兩次，用無菌瓶分裝，在4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

大腸桿菌菌種：石河子大學食品微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

試劑：K2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaCl、乙醇、戊二醛、環(huán)氧樹脂、丙酮、醋酸鈾均為分析純；二氧化碳純度為99.9%。

1.1.2 儀器與設備

219A-1171 型超薄切片機，H-600 型透射電鏡，超臨界設備（天津市華泰森淼生物工程技術有限公司HPP.L.2-600/0.6），電熱培養(yǎng)箱，打漿機，高速冷凍離心機，精密電子天平，生化培養(yǎng)箱，電子天平，滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌菌懸液的制備

漢晉之際，九品中正制確立、門閥制度盛行、莊園經(jīng)濟繁榮以及天人感應神學體系崩潰，玄學思潮興盛，道家思想得到了復興、勃發(fā)，促進了人的覺醒、藝術的自覺，推動著藝術精神的獨立，都在客觀上催生了江南藝術世家的形成。值得注意的是，以瑯邪王氏、陳郡謝氏為代表的江南藝術世家，不僅有著深厚的藝術修養(yǎng)，而且以家族為單位踐行著家族式的藝術傳承，這對于漢魏六朝藝術的繁榮和發(fā)展有著重要意義，也深刻影響著后世藝術的創(chuàng)作與傳承。

大腸桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中于37 ℃活化24 h，再接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于3 000 r/min 下離心10 min 后棄去上清液，菌體重新懸浮于一定量的生理鹽水中。基于預試驗結果取100 mL接種到1 000 mL 哈密瓜汁中制成菌懸液，然后將其分裝于100 mL 的無菌大試管中，每管裝量50 mL[7-8]。

1.2.2 超高壓二氧化碳殺菌處理

將超臨界設備的處理釜預熱到設定的溫度，然后將裝有50 mL 哈密瓜汁的試管置于處理釜中（釜提前經(jīng)過75%酒精消毒），關閉放氣閥，打開進氣閥，經(jīng)過5～10 min 的升壓過程達到設定的壓力，哈密瓜汁在不同的壓力（10、20、35 MPa）和溫度（35、45、55 ℃）分別處理10～70 min，樣品處理結束后，關閉進氣閥，打開放氣閥，經(jīng)過約15～20 min 卸壓，將哈密瓜汁取出，迅速加蓋冷卻[9-10]。

1.2.3 超臨界二氧化碳抑制哈密瓜汁中大腸桿菌的動力學分析

在無菌操作條件下，按《食品微生物檢驗國家標準》（GB 4789—2003），采用平板傾注計數(shù)法進行菌落計數(shù)。以無菌生理鹽水或者蒸餾水適當稀釋超臨界CO2處理前后樣品，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，菌落記數(shù)[11-12]。每一樣品取3 個稀釋度，不同稀釋度接種3 個平板，選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板進行計數(shù)。滅菌效果采用菌落存活對數(shù)lgNt/N0（Nt：處理t時間后每毫升活菌數(shù)；N0：初始菌濃度）表示。

超臨界CO2對哈密瓜汁中大腸桿菌的殺菌效果，用一級反應動力學公式分析：

式中：t表示處理時間（min），D為微生物（或芽孢）的活菌數(shù)減少90%所需要的時間（min），k為在給定壓力或溫度值時的滅菌速率常數(shù)（min-1）。

分別取經(jīng)超臨界CO2處理和未經(jīng)處理的大腸桿菌菌液50 mL，在離心管中以3 500 r/min 離心3～5 次（離心的轉(zhuǎn)速不能太大，以保證菌體不因為離心的機械運動而受損），吸取上清液，然后將沉淀的菌體轉(zhuǎn)移至0.5 mL 的微量離心管中，繼續(xù)以3 000 r/min 離心20 min。最后將沉淀的菌體用3%戊二醛固定，用pH為6.8 的磷酸緩沖液反復洗滌3～5 次，再以1%鋨酸固定過夜，然后用不同梯度（30%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇依次脫水，每次脫水15 min，再以95%乙醇脫水20 min，無水乙醇脫水兩次，每次20 min，丙酮脫水兩次，每次20 min，然后加入3∶1 的丙酮與環(huán)氧樹脂作用2 h，再加入1∶1 的丙酮與環(huán)氧樹脂作用4 h，加入純環(huán)氧樹脂滲透3 h，然后在50 ℃下以環(huán)氧樹脂包埋48 h。包埋后用超薄切片機切制70 nm 切片，放入230 目的銅網(wǎng)中。切片以醋酸鈾作用30 min 進行染色，水洗后加入檸檬酸鉛作用20 min，水洗。于H-600 型透射電鏡下觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 超臨界二氧化碳處理大腸桿菌的動力學分析

2.1.1 35 ℃下大腸桿菌存活對數(shù)與處理時間的關系

在35 ℃下采用不同壓力進行處理，大腸桿菌的存活對數(shù)隨著保壓時間的延長而降低（圖1）。不同壓力下的殺菌過程均分為兩個階段，第1 階段的滅菌速率大于第2 個階段。在溫度相同的條件下，壓力從10 MPa 升至35 MPa，第1 階段滅菌速率由0.214 6 min-1增加至 0.394 7 min-1，D值從 10.7 min 減少至 5.83 min（表1）；第2 個階段的滅菌速率則由0.079 8 min-1增加至 0.108 min-1，D值從 28.9 min 減少至 21.32 min，壓力增大大腸桿菌死亡速率也增大。在35 ℃，35 MPa超臨界CO2可降低哈密瓜汁中的大腸桿菌5.74 個數(shù)量級。

2.1.2 45 ℃下大腸桿菌存活對數(shù)與處理時間的關系

在45 ℃下，壓力從10 MPa 上升到35 MPa，大腸桿菌的存活數(shù)量級顯著降低（圖2）。10 MPa 兩個殺菌階段的R2分別為0.992 9 和0.971 1，第1 個殺菌過程的滅菌速率（0.305 8 min-1）比第2 個過程的殺菌速率（0.092 2 min-1）大的多（表 2）。20 MPa 兩個殺菌階段的R2分別為0.993 2 和0.989 5，線性擬合程度非常好。第1 個殺菌過程的死亡速率（0.360 2 min-1）也明顯高于第2 個過程的死亡速率（0.132 min-1）。35 MPa壓力下的滅菌規(guī)律基本相似。壓力從10 MPa 升至20 MPa，第1 階段滅菌速率由0.305 8 min-1增加至0.360 2 min-1，D值也從 7.53 min 減少至 6.39 min；第2個過程的滅菌速率則由0.0922min-1增加至0.132min-1，D值從24.97 min 減少至17.45 min。表明第1 階段增加壓力死亡速率增加緩慢，而殺菌第2 階段壓力增加時死亡速率增加較快。壓力由20 MPa 上升到35 MPa，兩個階段的死亡速率分別增至0.392 4 min-1和 0.171 4 min-1，D值減少至 5.86 min 和 13.44 min。在45 ℃下，35 MPa 超臨界二氧化碳處理后可降低哈密瓜汁中大腸桿菌7.22 個數(shù)量級。

表1 35 ℃下超臨界CO2 對大腸桿菌的滅菌動力學方程與參數(shù)Table 1 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 35 ℃

表2 45 ℃下超臨界CO2 對大腸桿菌的滅菌動力學方程與參數(shù)Table 2 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 45 ℃

2.1.3 55 ℃下大腸桿菌存活對數(shù)與處理時間的關系

由圖3 可以看出，在55 ℃下，壓力從10 MPa 上升到35MPa，兩個殺菌階段的大腸桿菌的存活數(shù)量級均顯著降低（P＜0.05）。不同壓力下第1 階段的滅菌速率均顯著大于第2 階段，而第2 殺菌階段的D值均大于第1 階段（表3）。從10 MPa 增至35 MPa，第1殺菌階段的死亡速率由0.351 9 min-1分別增至0.399 3 min-1和 0.441 7 min-1，D值由 6.54 min 依次減小到5.77 min 和5.21 min，第2 殺菌階段的死亡速率由 0.094 9 min-1增至 0.153 6 min-1和 0.207 7 min-1，D值由24.27 min 依次減小到14.99 min 和11.09 min。

表3 55 ℃下超臨界CO2 對大腸桿菌的滅菌動力學方程與參數(shù)Table 3 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 55 ℃

2.2 溫度和壓力對超臨界二氧化碳殺菌效果的影響

由圖4、5 可以看出，隨著溫度和壓力的升高大腸桿菌死亡速率也在上升。kt反應了大腸桿菌對溫度的敏感程度，kt越大，大腸桿菌對超臨界處理的溫度越敏感。kp反應了大腸桿菌對壓力的敏感程度，kp越大，大腸桿菌對超臨界處理的壓力越敏感。滅菌速率kt、kp與溫度、壓力均有良好的線性關系，說明溫度、壓力越高大腸桿菌敏感度越強。

2.3 超臨界處理大腸桿菌的超微結構的變化

由圖8 可看出，未處理的大腸桿菌外殼光滑，電鏡下電子密度較均勻。超臨界CO2處理大腸桿菌后，細胞內(nèi)的物質(zhì)被分成小塊，電鏡下的大腸桿菌出現(xiàn)大量的透電子區(qū)，細胞壁有破裂現(xiàn)象。這可能是因為CO2分子在高壓下，進入細胞內(nèi)部，擾亂了細胞的新陳代謝，破壞了一些關鍵酶的活性，也可能因為超臨界二氧化碳作為介質(zhì)滲透到細胞內(nèi)部，很快達到細胞內(nèi)外的壓力平衡，然后突然降壓導致胞內(nèi)外壓差急劇變化，細胞劇烈膨脹而發(fā)生破裂，從而達到破壁的效果[12]，使得細胞死亡。35 MPa 下大腸桿菌細胞有明顯的胞漿泄漏現(xiàn)象，部分細胞壁消失。

3 結論

（1）超臨界 CO2在壓力 10～35 MPa、溫度 35～55 ℃、時間10～70 min 的條件下處理哈密瓜汁中大腸桿菌，其滅活過程包括由快到慢兩個殺菌階段，兩個階段均符合一級反應動力學。

（2）在 35～55 ℃、10～35 MPa 條件下進行超臨界二氧化碳處理，隨溫度和壓力的提高，大腸桿菌的滅菌速率逐步上升。

（3）經(jīng)過超臨界CO2處理的大腸桿菌，細胞內(nèi)的物質(zhì)被分成小塊，細胞出現(xiàn)缺陷，透電子區(qū)分布不均勻。35 MPa 下超臨界CO2處理的大腸桿菌，有明顯的胞漿泄漏現(xiàn)象，結構層次感完全消失，部分細胞壁消失。