荸薺查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆與表達(dá)分析

陳夏鑫, 陳振林, 帥 良, 段振華, 商飛飛, 宋慕波,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899）

荸薺（Eleocharis dulcis）又名馬蹄，原產(chǎn)于我國南部，為莎草科淺水草本植物。荸薺球莖膨大，是其主要的食用部位，因其口感爽脆、亦果亦蔬的特點自古有“江南人參”的美譽(yù)[1]。荸薺球莖生長于淺水污泥之中，削皮困難，因此方便衛(wèi)生的鮮切荸薺產(chǎn)品深受消費者歡迎。荸薺外皮較厚，帶皮貯藏相對容易，但經(jīng)切削處理的荸薺極易發(fā)生黃化。以往的研究表明，鮮切荸薺的黃化與黃酮類物質(zhì)的積累有關(guān)。Pan 等[2]在黃化的鮮切荸薺表面組織中分離得到了柚皮素和圣草酚兩種黃酮類物質(zhì)。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時間的延長，鮮切荸薺表面組織中柚皮素和圣草酚的含量快速提高，與荸薺表面黃化程度成正相關(guān)[3]。查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）是苯丙烷代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，在黃酮的生物合成過程中起關(guān)鍵作用。植物中查爾酮在CHI 的催化下形成二氫黃酮類化合物，進(jìn)而推動下游黃酮類物質(zhì)的合成[4]。與其他苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因類似，CHI 的表達(dá)水平受到外界環(huán)境的調(diào)控，如強(qiáng)光、干旱和機(jī)械損傷等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械傷信號能夠誘導(dǎo)植物CHI 的表達(dá)，從而導(dǎo)致更多新酶合成[6]。同時，研究發(fā)現(xiàn)銀杏[7]和水稻[8]等植物的CHI 表達(dá)與類黃酮物質(zhì)的積累關(guān)系密切。目前針對CHI 基因的研究多集中在高等植物葉片和花中，其在植物莖中，特別是在莖組織響應(yīng)機(jī)械傷過程中的表達(dá)調(diào)控研究較少。目前仍未在荸薺中克隆到CHI 基因。本研究利用cDNA 末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆荸薺CHI 基因全長，對其序列特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)研究其在不同組織和鮮切荸薺貯藏過程中的表達(dá)特征，以期為鮮切荸薺黃化控制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

新鮮荸薺購于廣西賀州市八步區(qū)農(nóng)產(chǎn)品市場，運(yùn)回實驗室經(jīng)清洗，挑選大小均一、無機(jī)械損傷和病蟲害的果實，去皮后橫切成厚度為0.5 cm 的圓片，樣品分成兩組，對照組在清水中浸泡10 min，處理組在10 mmol·L-1水楊酸水溶液中浸泡10 min，樣品晾干后置于塑料托盤中用0.02 mm 厚聚乙烯膜包裝，于10 ℃下貯藏。在貯藏 0、2、4、6、8 d 分別取樣，將樣品放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)基因克隆和表達(dá)分析。

植物RNA 提取試劑盒：華越洋生物科技（北京）有限公司產(chǎn)品；SMARTer RACE 5′/3′Kit RACE 試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix 熒光定量酶、PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄去基因組試劑盒：均為日本Takara 公司產(chǎn)品；溴化乙錠：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；DNA 凝膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖西班牙 Biowest 公司；Tris、乙醇、EDTA-Na2：均為分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SQ510C 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，5424 R 型高速冷凍離心機(jī)，G-1000 型 PCR 儀，DYY-6D 型電泳儀，DYCP-31DN 型水平電泳槽，ZF-368 型凝膠成像系統(tǒng)，K5600 型超微量分光光度計，CFX Connect 型熒光定量PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

采用植物RNA 提取試劑盒提取荸薺總RNA，具體方法按照說明書進(jìn)行。得到RNA 后利用K5600 型超微量分光光度計測定其純度和含量，RNA 樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于反轉(zhuǎn)錄等后續(xù)試驗。

1.2.2 基因克隆

3′RACE-cDNA 和 5′RACE-cDNA 的合成具體操作按照 SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE 試劑盒進(jìn)行。根據(jù)之前從荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的CHI 基因片段設(shè)計 3′RACE 和 5′RACE 引物（表 1）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收、連接（pRACE vector）、轉(zhuǎn)化（Stellar 感受態(tài)細(xì)胞）、重組子篩選及菌液PCR 鑒定后，委托華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 基因克隆和表達(dá)分析所用引物Table 1 Primers used for cloning and expression analysis

1.2.3 基因生物信息學(xué)分析

采用 NCBI 中的 BLASTN、BLASTP 程序進(jìn)行核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性比較；ORF finder 程序?qū)ふ议_放閱讀框；采用ProtParam Tool 分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；采用Conserved Domains 分析氨基酸序列的保守區(qū)域；采用TargetP 1.1 Server 進(jìn)行氨基酸序列導(dǎo)肽的分析；采用SignalP 4.0 Server 預(yù)測蛋白的信號肽；采用Post Prediction 和SubLocv 1.0 進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位信號預(yù)測；ProtScale 以Hphob./Kyte&Doolittle 算法進(jìn)行親疏水性預(yù)測；使用NetPhos 2.0 Server 預(yù)測蛋白質(zhì)序列的磷酸化位點；使用ExPaSy-SOPMA 軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；使用ClustaW 1.83 軟件進(jìn)行多重序列比對；采用Mega 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建；采用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 酶活性測定

CHI 活性的測定參照姜悅等[9]的方法略作調(diào)整。取鮮切荸薺組織表層1.0 g，加入5 mL 50 mmol·L-1緩沖液（pH 7.5，內(nèi)含 50 mmol·L-1抗壞血酸鈉、10 mmol·L-1DTT 和0.1%Triton X-100），冰浴中研磨?；旌衔镛D(zhuǎn)移至 50 mL 離心管，于 4 ℃下 12 000 r·min-1離心 20 min，所得上清為粗酶液。取0.4 mL 粗酶液，加入4 mL Tris-HCl 緩沖液（50 mmol·L-1、pH 7.5，內(nèi)含 7.5 mg·mL-1牛血清蛋白和 50 mmol·L-1NaHSO3），1 mg·mL-1查爾酮溶液100 μL 引發(fā)反應(yīng)，45 ℃恒溫水浴中保溫30 min，最后加入 6 mol·L-1鹽酸（2 mL）終止反應(yīng)。對照反應(yīng)液中的粗酶液由蒸餾水代替。在381 nm 波長處測定吸光值，以每分鐘OD 變化0.01 為一個CHI活性單位(U)，酶活性單位為U/(g FW)。

1.2.5 基因表達(dá)分析

根據(jù)獲得的CHI 基因序列利用Primer 5.0 設(shè)計定量PCR 特異引物（表1）。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit 去基因組及反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成Q-PCR 的模板cDNA，操作方法見說明書。參考Takara 公司的SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增。利用2—△△Ct方法計算表達(dá)量。各樣品的表達(dá)量均為3 次生物重復(fù)的平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用3 次重復(fù)的平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺CHI 基因的克隆

在鮮切荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因中篩選得到1 條與其他植物CHI 基因序列同源性較高的mRNA 序列片段。NCBI 的 BLASTN 比對結(jié)果顯示，該片段與多種植物的CHI 基因mRNA 序列相似度在75%以上，其中與水稻（Oryza sativa，XM_015772801）和黑麥（Secale cereale，KC788194）CHI 基因的 mRNA序列同源性最高。利用該片段設(shè)計3′ RACE 和5′RACE 引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后獲得3′和5′端序列分別約為450 bp 和750 bp（圖1 A）。將片段回收后進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)3′端序列長度為366 bp，包含了3′非翻譯區(qū)（3′UTR）及 Poly A 結(jié)構(gòu)；5′端序列長度為 747 bp 包含了 5′非翻譯區(qū)（5′UTR）。同時，根據(jù)拼接后獲得的cDNA 全長序列設(shè)計引物，以荸薺基因組為模板，克隆得到了編碼區(qū)DNA 序列全長，該序列長度為1 182 bp（圖 1B）。

將所得全長cDNA 序列使用ORF Finder 在線軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)克隆得到的CHI 基因cDNA 全長為1003bp，含有一個744bp 的最大開放閱讀框（ORF）、131 bp 的 5′UTR 區(qū)、130 bp 的 3′UTR 區(qū)及 31 bp 的Poly A 結(jié)構(gòu)，終止密碼子為TGA。將該cDNA 全長序列在NCBI 上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與水稻和黑麥的CHI 基因相似度較高，為76%。因此，可證明已經(jīng)克隆獲得荸薺CHI 基因，將此基因命名為CwCHI，其GenBank Accession Number 為 MG719238。CwCHI編碼區(qū)DNA 全長 1 182 bp，與cDNA 比對發(fā)現(xiàn)，CwCHI的DNA 中有3 個內(nèi)含子和4 個外顯子，其分布如圖2 所示。

2.2 CwCHI 生物信息學(xué)分析

CwCHI編碼蛋白由247 個氨基酸組成。經(jīng)預(yù)測，其分子量為26.410 kD；理論等電點為4.89；分子式為C1197H1852N302O357S7；總原子數(shù)為 3 715 個。CwCHI蛋白中最多的氨基酸是丙氨酸（Ala）占12.1%。蛋白整體親水指數(shù)（GRAVY）為0.058，脂溶指數(shù)為86.56。

利用 NCBI 的 Blast p 和 Conserved domains 進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CwCHI蛋白屬于Chalcone_3 super family超家族。CwCHI蛋白含有4 個酪蛋白激酶Ⅱ識別位點，分別位于 14～17、28～31、136～139、176～179；2 個蛋白激酶 C 識別位點分別位于 78～80、118～120；以及2 個 N-豆蔻?；稽c分別位于 48～53、207～212。TMPred 軟件預(yù)測顯示，CwCHI蛋白分別有兩個由內(nèi)到外（46～63,158～174）和由外到內(nèi)（37～56,157～173）的跨膜區(qū)域。使用在線軟件ProScale 預(yù)測發(fā)現(xiàn)CwCHI蛋白疏水區(qū)域與預(yù)測的跨膜區(qū)域基本一致（圖 3）。

CwCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占38.06%，其他結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占33.6%，延伸鏈占19.84%，β-折疊結(jié)構(gòu)占8.5%。采用Swiss-model 以系統(tǒng)自動匹配南極毛草為模板（5yx4.1.A）對CwCHI蛋白進(jìn)行同源建模（圖4），CwCHI的三級結(jié)構(gòu)中α-螺旋是最明顯的結(jié)構(gòu)組件。

通過與其他物種CHI 型蛋白進(jìn)行多重比對發(fā)現(xiàn)，CHI 氨基酸序列較為保守（圖5），尤其是組成活性位點的氨基酸殘基的保守程度更高，表明CHI 作為植物黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶，在進(jìn)化的過程中保持了較高的遺傳穩(wěn)定性。與其他Ⅰ型CHI 蛋白類似，在決定底物偏好性的第201 位氨基酸為Ser。采用MEGA 5 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，CwCHI與油棕櫚和菠蘿的CHI 蛋白親緣關(guān)系較近（圖 6）。

（2）星號標(biāo)注的氨基酸殘基參與活性位點的組成；三角符號標(biāo)注的氨基酸殘基參決定底物的偏好性。

2.3 CwCHI 基因在荸薺不同組織中的表達(dá)分析

黃酮的合成在荸薺的不同組織中廣泛存在，本研究采用熒光定量PCR 技術(shù)分析CwCHI基因在根、葉、荸薺皮和荸薺肉中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，CwCHI基因在4 個組織中均有表達(dá)，其中荸薺皮中的表達(dá)水平最高，而在荸薺肉的表達(dá)最低（P＜0.05）（圖7）。

2.4 鮮切荸薺黃化過程中CHI 活性變化及CwCHI的表達(dá)分析

水楊酸處理能夠顯著抑制鮮切荸薺的黃化。鮮切荸薺在貯藏過程中，對照組CHI 活性呈上升趨勢，在貯藏4 d 后酶活性快速提高。10 mmol·L-1水楊酸處理能夠顯著抑制鮮切荸薺CHI 活性的上升（圖8 A）。

通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，貯藏過程中對照組CwCHI的表達(dá)水平快速提高，2 d 時CwCHI表達(dá)量是0 d 的40.6 倍，之后表達(dá)量繼續(xù)升高，貯藏6 d 后表達(dá)量逐漸下降，在8 d 時CwCHI基因表達(dá)水平仍顯著高于0 d（P＜0.05）（圖 8 B）。水楊酸處理組CwCHI的表達(dá)量在貯藏過程中各時間點均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖8 B）。

3 討論與結(jié)論

鮮切荸薺黃化與傳統(tǒng)多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）參與的酶促褐變不同，苯丙烷代謝中間產(chǎn)物柚皮素和圣草酚的積累是導(dǎo)致表面黃化的主要原因[10]。苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)受多種環(huán)境因素的調(diào)控[5]。以往研究表明，傷信號能夠誘導(dǎo)CHI 的表達(dá)，促使新酶合成，從而導(dǎo)致植物組織中黃酮的積累[6,11]。因此，鮮切荸薺貯藏期間CHI 活性變化及其編碼基因表達(dá)的調(diào)控與黃化現(xiàn)象可能存在密切關(guān)系。本研通過克隆荸薺CHI 基因全長，并研究其在鮮切荸薺貯藏過程中的表達(dá)模式，為揭示荸薺黃化的機(jī)理和尋找抑制黃化的方法奠定基礎(chǔ)。

由于CHI 與觀賞植物花色素的形成關(guān)系密切，因此在多種花卉中已經(jīng)克隆得到了CHI 基因。吳彥慶等[12]在芍藥中克隆得到的CHI 基因，其cDNA 編碼區(qū)長度為898 bp。桂花中克隆得到的OfCHI基因編碼區(qū)長度為747 bp，可編碼248 個氨基酸[13]。本研究在荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了1 個與其他植物CHI 基因同源性較高的基因片段，通過RACE 技術(shù)從荸薺中克隆得到其cDNA 全長序列和全長DNA 序列。該基因mRNA 全長為1 003 bp，有一個長度為744 bp的開放閱讀框，可編碼247 個氨基酸，將其命名為CwCHI。CwCHI編碼區(qū)對應(yīng) DNA 長度為 1 182 bp，其中有3 個內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子和外顯子的交界序列均符合GT-AG 規(guī)則。CHI 基因在植物界存在CHIⅠ和CHIⅡ兩種類型，其中CHIⅠ存在于葡萄、擬南芥和大麥等多種植物中，而CHIⅡ則存在于豆科植物中[14-15]。CHIⅠ只能以柚皮素查爾酮為底物，而CHI Ⅱ則可以同時以異甘草素和柚皮素查耳酮為底物[16]。豆科植物中CHI Ⅱ具有4 個外顯子和3 個內(nèi)含子的典型結(jié)構(gòu)[17-18]。本研究克隆得到的CwCHI雖然也具有4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，但其蛋白保守域卻與CHIⅠ型相同，決定底物類型的Ser-201 也與其他CHIⅠ型相同，而在CHIⅡ型中該殘基為Thr[19]。

CHI 基因的表達(dá)水平與植物黃酮類物質(zhì)的合成關(guān)系密切，其表達(dá)有明顯的組織特異性，且在不同物種中的表達(dá)模式存在差異。在桂花中，CHI 基因在莖中的表達(dá)最高，而在花中的表達(dá)最低[13]。在臍橙中，CHI 基因的表達(dá)在根中最高，在葉中最低[20]。通過對荸薺不同組織CwCHI的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在根、葉、荸薺皮和荸薺肉中均有表達(dá)，而在荸薺肉中的表達(dá)水平最低。

鮮切果蔬受到機(jī)械損傷后，受傷組織苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平快速提高，這是植物對機(jī)械損傷響應(yīng)的重要表現(xiàn)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏初期對照組鮮切荸薺CHI 的酶活性與CwCHI表達(dá)水平較低，但隨著貯藏時間的延長均呈快速上升趨勢，表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。Peng 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理能明顯抑制鮮切荸薺的黃化，但其抑制黃化的機(jī)理仍不清楚。在本研究中，10 mmol·L-1水楊酸處理顯著抑制了鮮切荸薺貯藏過程中CHI 的酶活性和CwCHI的表達(dá)。以上結(jié)果表明，鮮切荸薺貯藏過程中CHI 活性和CwCHI表達(dá)水平的提高與其表面黃化關(guān)系密切，水楊酸處理對CHI 活性和CwCHI表達(dá)的抑制可能是其延緩鮮切荸薺黃化的原因。