PI3K-p85與Caspase-3在脂多糖/氨基半乳糖誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究

師 婷 宋維芳 許瑞齡

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 山西汾陽(yáng) 032200；①山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室

肝臟疾病可由肝炎病毒、化學(xué)毒物、藥物、酒精等因素引起，這些因素首先可引發(fā)急慢性肝損傷，如未及時(shí)治療，將會(huì)引起嚴(yán)重肝損傷和肝衰竭從而威脅患者生命[1]。在重癥監(jiān)護(hù)室中，有20%的患者會(huì)發(fā)生肝損傷和肝衰竭，近幾十年臨床肝損傷和衰竭的發(fā)生率明顯升高，并顯著增加患者病死率[1-2]。肝損傷是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞遭受嚴(yán)重?fù)p害的結(jié)果，其病情發(fā)展迅速、兇險(xiǎn)，常導(dǎo)致大面積肝臟組織淤血、壞死，肝臟細(xì)胞壞死、凋亡，肝功能衰竭等典型臨床表現(xiàn)[2-3]。雖然目前已經(jīng)有大量研究工作探討其發(fā)生機(jī)制，但由于肝損傷機(jī)制極其復(fù)雜，至今尚未完全闡明。筆者前期研究以LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷為模型，證明在損傷初期和中期自噬作用和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用加強(qiáng)，對(duì)肝臟具有一定保護(hù)作用[4-5]。本研究進(jìn)一步探討凋亡在其中的作用及可能的信號(hào)通路，重點(diǎn)探索PI3K通路和凋亡過程標(biāo)志蛋白caspase-3的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 雄性健康清潔級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量為(25±5)g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑 ALT/GPT試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司研究所；Caspase-3、PI3K-p85多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自北京中杉金橋公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要方法

1.3.1肝損傷模型建立 造模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中常規(guī)飼料、自來水飼養(yǎng)1周以適應(yīng)周圍環(huán)境并確保動(dòng)物健康后開始實(shí)驗(yàn)。把動(dòng)物按照隨機(jī)分組的方法，分為對(duì)照組(n=6)和損傷組。將損傷組再隨機(jī)分為注射LPS/GalN后1小時(shí)組(n=6)、注射LPS/GalN后3小時(shí)組(n=6)、注射LPS/GalN后6小時(shí)組(n=8)。以下分別簡(jiǎn)稱對(duì)照組(N組)、損傷組、損傷1小時(shí)組、損傷3小時(shí)組、損傷6小時(shí)組。將各組動(dòng)物分別進(jìn)行稱重，并用剪耳朵法進(jìn)行編號(hào)。配制LPS、D-GalN、生理鹽水、酸的混合溶液，損傷組每只動(dòng)物腹腔注射0.2mL混合藥液(含5μgLPS+0.02gGalN)，對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水0.2mL/只。

1.3.2測(cè)血清ALT 各組動(dòng)物按照設(shè)計(jì)分別于注藥后不同時(shí)間內(nèi)，取左眼內(nèi)眥血，離心后取血清100μL。嚴(yán)格按照ALT測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行各項(xiàng)操作步驟，制備ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)各組樣本吸光度值在Excel表中用擬合公式計(jì)算樣本中ALT活力。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡(Western-blot) 各組取左眼內(nèi)眥血后，頸椎脫臼處死并快速取肝臟放入4℃無菌生理鹽水中進(jìn)行清洗后用高溫消毒后的錫箔紙包好，迅速放入液氮瓶中冷凍后存放于-80 ℃冰箱。稱取各組肝組織200mg，在研磨皿中加入液氮后迅速放入肝臟組織研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到勻漿器中。迅速將2mL預(yù)冷的裂解緩沖液加入勻漿器中，快速充分研磨后置于碎冰中。將組織研磨液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心EP管中，放入4℃冰箱裂解30分。離心(4℃，14000轉(zhuǎn)，25分)后，取上清液移至新的1.5mLEP離心管中，獲得組織蛋白粗提取液?？捡R斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。加入5x SDS上樣緩沖液，96 ℃加熱6min，以β-actin為內(nèi)參，12% SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，麗春紅染色確定條帶位置進(jìn)行剪裁，室溫5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，Caspase-3抗體(1:1000)與PI3K-p85抗體(1:1000)4℃分別孵育過夜，II抗(1:5000)室溫孵育1小時(shí)，化學(xué)發(fā)光法顯色。掃描并用軟件分析灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.4肝臟組織HE染色 將各組肝臟用無菌生理鹽水清洗之后，取一葉迅速放入4%多聚甲醛中固定24小時(shí)以上，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用ImageJ計(jì)算灰度值，GraphPad Prism 5.0軟件分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，以P<0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1腹腔注射LPS/GalN后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肝臟組織的影響 肝臟HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索排列整齊呈放射狀，細(xì)胞核圓而清晰。與對(duì)照組比較，損傷1小時(shí)、3小時(shí)組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整；而損傷6小時(shí)組肝臟組織淤血損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞之間邊界不清，呈現(xiàn)大量藍(lán)色，粉色的細(xì)胞漿出現(xiàn)溢出，核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂，提示肝損傷嚴(yán)重。見圖1。

圖1 LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷不同時(shí)間段肝臟病理學(xué)切片HE染色(×400)

2.2血清ALT表達(dá) 與對(duì)照組比較，損傷3小時(shí)組的血清ALT水平開始增高(P<0.05)；損傷6小時(shí)組較其余3組，血清ALT水平顯著增高(P<0.05)；提示肝功能異常，見表1。

表1 各組小鼠血清ALT含量比較(n=6)

2.3Caspase-3在LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷中表達(dá)變化 圖2顯示，與對(duì)照組比較，LPS/GalN損傷后1小時(shí)時(shí)，Caspase-3表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，損傷3小時(shí)時(shí)表達(dá)升高(P<0.05)；與對(duì)照組、損傷1小時(shí)組、損傷3小時(shí)組比較，損傷6小時(shí)組Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

圖2 LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷不同時(shí)間段Caspase-3蛋白的表達(dá)

2.4PI3Kp85在LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷中表達(dá)變化 檢測(cè)肝臟PI3K-p85蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明：損傷1小時(shí)、3小時(shí)組PI3K-p85蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，損傷6小時(shí)組PI3K-p85蛋白的表達(dá)水平較損傷1小時(shí)、3小時(shí)組顯著降低(P<0.05)，見圖3。說明肝損傷早期即可誘導(dǎo)PI3K-p85的表達(dá)，晚期則表達(dá)下降。

圖3 LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷不同時(shí)間段PI3K-p85蛋白的表達(dá)

3 討論

肝細(xì)胞大面積死亡是肝臟疾病的一個(gè)共有病理改變。大量資料表明，凋亡和壞死參與了多種肝臟疾病，如急性肝損傷、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和肝癌等[6]。急性肝損傷晚期，會(huì)表現(xiàn)為較多肝細(xì)胞凋亡。因此，抑制肝細(xì)胞凋亡，可有效減輕肝損傷。LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是經(jīng)典肝損傷模型，最終動(dòng)物爆發(fā)嚴(yán)重肝功能衰竭而死亡，常被用于肝臟疾病及藥物研究的動(dòng)物模型。筆者前期研究證明，在LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)隨肝損傷程度加重而明顯增強(qiáng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP隨肝損傷程度加重也明顯增強(qiáng)[4-5]，提示，自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了急性肝損傷過程。本研究中，1小時(shí)組較對(duì)照組ALT含量變化不明顯，3小時(shí)組較對(duì)照組ALT含量變化顯著升高，6小時(shí)組較對(duì)照組、1小時(shí)組、3小時(shí)組ALT含量顯著升高；鏡下觀察，損傷6小時(shí)組肝臟細(xì)胞核濃縮、深染較多，且6小時(shí)組Caspase-3表達(dá)較1、3小時(shí)組顯著升高。表明LPS聯(lián)合GalN作用肝臟3小時(shí)內(nèi)損傷較輕，6小時(shí)時(shí)損傷嚴(yán)重且凋亡細(xì)胞增多。提示PI3K信號(hào)通路激活參與了早期肝損傷過程，PI3K信號(hào)通路抑制與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加參與了晚期肝損傷。

引起急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中凋亡起著很重要的作用，因此抑制凋亡是治療肝損傷的有效途徑之一。PI3K信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的1條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與細(xì)胞凋亡、增殖、周期等生物學(xué)行為密切相關(guān)[7]。PI3K是生長(zhǎng)因子受體超家族中重要成員，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)家族成員，影響非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化、肝癌等的發(fā)生發(fā)展[8-10]，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖代謝[11]。p85亞基是PI3K調(diào)節(jié)亞基，在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖代謝、癌癥中起重要作用[11-12]。但是p85亞基參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷影響尚未清楚。本研究采用LPS聯(lián)合GalN 誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。通過肝臟組織免疫組化染色和血清ALT檢測(cè)對(duì)LPS/GalN處理后3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(1、3和6小時(shí))的肝臟損傷程度進(jìn)行觀察。這種損傷變化與筆者前期研究結(jié)果相一致[4]。充分說明LPS/GalN處理具有引起肝功能障礙并誘導(dǎo)肝臟淤血損傷的效應(yīng)。再通過Western blot觀察LPS/GalN損傷后不同時(shí)間Caspase-3和PI3K-p85的表達(dá)變化(圖2、3)。結(jié)果證明，LPS/GalN作用6小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3表達(dá)逐漸增加，晚期最多；而PI3K-p85在肝損傷初期即有表達(dá)增加，在肝損傷晚期表達(dá)明顯下調(diào)。提示PI3K-p85參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LPS/GalN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡機(jī)制中可能發(fā)揮重要靶分子作用。

綜上所述，推測(cè)PI3K通路激活在肝損傷初期可能減輕了LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷，后期PI3K通路抑制凋亡增強(qiáng)參與了晚期肝損傷過程。至于其它信號(hào)通路是否也參與LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝臟細(xì)胞凋亡，有待今后繼續(xù)探究。