丙泊酚對(duì)肝臟缺血再灌注中線粒體功能和氧化應(yīng)激的影響

夏樂(lè)強(qiáng)， 張先杰， 劉 欣， 王 瑛， 高紅強(qiáng)

（1.德陽(yáng)市人民醫(yī)院麻醉科，德陽(yáng) 618000； 2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院肝膽外科，昆明 650000）

手術(shù)過(guò)程中（如腫瘤切除、血管重構(gòu)、移植）阻斷肝臟血流后再灌注會(huì)導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重?fù)p傷[1]。肝臟缺血再灌注中最常見(jiàn)的病理機(jī)制涉及線粒體功能紊亂、活性氧化物和氧化應(yīng)激，線粒體破壞氧化磷酸化以及三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）產(chǎn)生，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，使膜通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，誘發(fā)凋亡[2]。在手術(shù)過(guò)程中的麻醉劑具有影響線粒體功能、增加ROS 產(chǎn)生以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。有報(bào)道[3]表明，吸入性麻醉劑七氟醚對(duì)于缺血再灌注有保護(hù)作用，提高線粒體功能、能量代謝抑制ROS 產(chǎn)生。丙泊酚是一種靜脈注射麻醉劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似自由基清道夫生育酚，生育酚能夠減少腦缺血再灌注時(shí)損傷與凋亡[4]。本研究旨在探討丙泊酚在肝臟缺血再灌注時(shí)對(duì)于線粒體功能、氧化還原平衡的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

雄性Wistar 大鼠購(gòu)自AnHui New Star Pharmaceutical Development 公司，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α ，HIF-1α）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司，anti-β-actin 抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。雄性Wistar 大鼠體質(zhì)量在150～200 g，隨機(jī)分為：替來(lái)他明處理的假手術(shù)組（SHAM）與肝臟缺血再灌注（I/R）組（腹腔注射 40 mg·kg-1的替來(lái)他明/唑拉西泮）；丙泊酚處理的 SHAM 組與I/R 組［尾靜脈注射 1 mg·（kg·min）-1丙泊酚］；七氟醚處理的SHAM 組與I/R 組（吸入2%七氟醚）。手術(shù)完成后采用脊椎脫臼法處死大鼠。

1.3 方法

1.3.1 谷胱甘肽測(cè)定 采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定肝臟中還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）以及氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）的含量。采用谷氨酸鹽+蘋果酸（復(fù)合物Ⅰ）關(guān)聯(lián)的底物或者琥珀酸鹽（魚藤酮抑制complex Ⅰ）（復(fù)合物Ⅱ）關(guān)聯(lián)的底物，分析離體肝臟線粒體呼吸鏈。

1.3.2 線粒體呼吸功能檢測(cè) 采用Lowry micromethod kit 試劑盒測(cè)定線粒體蛋白濃度。采用裝備有 Clark’s 電極和快速混合裝置的 oxygraph+液相氧測(cè)定儀檢測(cè)耗氧量。呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）即加入二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）后和 ADP 耗盡后的氧耗量的比值。RCR 反映線粒體膜的完整性和氧化磷酸化的偶聯(lián)程度。線粒體呼吸速率以單位時(shí)間內(nèi)每毫克線粒體蛋白消耗多少氧表示［nmol·（min·mg）-1］。

1.3.3 線粒體質(zhì)子漏分析 采用配置有Clark’s和 tetraphenylphosphonium（TPP+）電極的 oxygraph+液相氧測(cè)定儀進(jìn)行分析，用改良的nernst方程計(jì)算線粒體膜電位（Δψ）。

1.3.4 FOF1-ATPase 活性以及ATP 含量分析 偶聯(lián) NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）氧化的ATP 再生系統(tǒng)在ATP 水解之后檢測(cè)FOF1-ATPase 活性，用生物發(fā)光（Enliten ATP assay kit）檢測(cè)肝臟 ATP 含量。

1.3.5 檢測(cè)線粒體H2O2和自由基漏 以5 mM丙酮酸外加1 mM 蘋果酸或者5 mM 琥珀酸作為呼吸底物，采用Amplex Red 氧化之后，在37 ℃條件下檢測(cè)線粒體H2O2。檢測(cè)上清液熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為312 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，用 H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氧化產(chǎn)物。

1.3.6 檢測(cè)人中性粒細(xì)胞中線粒體彈性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE）蛋白加和物采用熒光光譜法測(cè)定4-羥基-2-壬烯醛與HNE蛋白形成的加和物。

1.3.7 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔PTP 分析 通過(guò)檢測(cè)線粒體腫脹分析線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔。每90 s加入20 μM Ca2+后，在540 nm 吸光值下分析細(xì)胞腫脹。

1.3.8 Western blot 向20 mg 肝臟組織加入400 μLRIPA 裂解液，勻漿后離心（13000×g，13 min），取上清。采用BCA（bicinchoninic acid）法檢測(cè)蛋白濃度。處理上樣蛋白，上樣量為40 μg。在8%SDS-PAGE 凝膠中分離。電泳完成后電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。PVDF 膜用5%脫脂牛奶室在室溫封閉 1 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min，在 4 ℃條件下與anti-HIF-1α 抗體孵育過(guò)夜。PBS 洗 3 次，每次5 min。孵育相應(yīng)的二抗。PBS 洗 3 次，每次 5 min。在膜上均勻撒ECL 化學(xué)發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

1.3.9 qRT-PCR 采用TRizol 試劑提取肝臟組織中的RNA，儀器采用Bio-Rad iCycler 熒光定量PCR 儀，采用SYBR Green 法進(jìn)行檢測(cè)。引物如下：TfR1-forward 5’-ATACGTTCCCCGTTGTT GAGG-3’，TfR1-reverse5’-GGCGGAAACTGAGTATGGTTGA-3’；HO-1-forward 5’-GACAAG GGTCAGGTGTC -3’，HO -1 -reverse 5’-AG －TAACTCCCACCTCGT-3’；HGTDP-forward 5’-ATGTTTCCTCGCCACTAA -3’，HGTDP -reverse 5’-CAGCGTCAAGCATCTCAA-3’；BNIP3-forward 5’-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3’，BNIP3-reverse 5’-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3’；GAPDH-forward 5’-AGGGCTGCTTTTAACTC TGGT-3’，GAPDH-reverse 5’-CCCCACTTGAT TTTGGAGGGA-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 6.05 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較使用配對(duì)t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，采用 χ2檢驗(yàn)或 χ2校正公式或 Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對(duì)線粒體呼吸活性的影響

I/R 損傷導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ與復(fù)合物 Ⅱ中RCR降低。與SHAM 大鼠相比，I/R 大鼠七氟醚組RCR值減少（P＜0.05），而 I/R 大鼠丙泊酚組 RCR 正常，I/R 損傷之后替來(lái)他明與七氟醚組肝臟線粒體無(wú)法維持膜電位，但在丙泊酚處理后可以維持膜電位，膜電位均高于I/R 大鼠替來(lái)他明和七氟醚組（P 均＜0.05）（表 1）。從 0 到 150 mV 隨著膜電位增加，呼吸速率增加緩慢，隨著膜電壓進(jìn)一步加大，呼吸速率增加加快（圖1A、1B、1C）。I/R 損傷之后，替來(lái)他明與七氟醚組呼吸速率與膜電壓相關(guān)線性斜率變化明顯（圖2A、2B），丙泊酚組沒(méi)有發(fā)生這種變化（圖2C）。

2.2 丙泊酚對(duì)肝臟中GSH、GSSG 及GSSG/GSH的影響

檢測(cè)SHAM 和I/R 大鼠不同處理組中肝臟GSH 和 GSSG 的含量，SHAM 大鼠中 3 組肝臟中GSH 和 GSSG 水平均相同（P 均＞0.05）。I/R 大鼠中，七氟醚與丙泊酚處理組肝臟中GSSG 水平均降低（P＜0.05 或＜0.01）；在 I/R 大鼠 丙泊酚組中，GSSG/GSH 比率均低于I/R 替來(lái)他明組和I/R 七氟醚組（P＜0.01）（表 2）。

2.3 丙泊酚對(duì)肝臟線粒體ROS 產(chǎn)生以及自由基漏的影響

復(fù)合物Ⅰ與復(fù)合物Ⅱ中，I/R 大鼠肝臟線粒體 H2O2產(chǎn)生高于 SHAM 大鼠（P＜0.05）。I/R 大鼠中丙泊酚處理之后H2O2產(chǎn)生低于七氟醚處理和替來(lái)他明處理（P 均＜0.05）（圖 3A、3B）。呼吸鏈中電子百分比［自由基漏（FRL）］在復(fù)合物Ⅰ與復(fù)合物Ⅱ中I/R 大鼠肝臟線粒體高于SHAM 大鼠（P均<0.05），但丙泊酚處理之后FRL 與七氟醚處理和替來(lái)他明處理相比降低（P 均<0.05）（圖3C、3D）。在替來(lái)他明與七氟醚大鼠中肝臟缺血再灌注之后線粒體HNE 蛋白加和物增加（P<0.05），但是丙泊酚組大鼠逆轉(zhuǎn)線粒體HNE 蛋白加和物增加（P<0.05）（圖 3E）。

表1 丙泊酚對(duì)線粒體呼吸活性的影響

表2 各組中GSH、GSSG 及GSSG/GSH 的比較

2.4 丙泊酚對(duì)ATP 損耗影響

與替來(lái)他明和七氟醚組相比，丙泊酚處理后，I/R 損傷降低肝臟ATP 儲(chǔ)存，部分逆轉(zhuǎn)ATP儲(chǔ)存減少（P 均<0.05），見(jiàn)圖4A。與替來(lái)他明和七氟醚組相比，丙泊酚處理后，I/R 損傷同時(shí)ATP合成酶（complexⅤ）活性降低，部分逆轉(zhuǎn)ATP 合成酶的降低（P 均<0.05）（圖 4B）。

2.5 丙泊酚對(duì)肝臟I/R 損傷PTP 開(kāi)放影響

PTP 開(kāi)放比例增加與替來(lái)他明組和七氟醚組相比，使用丙泊酚麻醉大鼠之后，隨著Ca2+濃度增加誘導(dǎo)I/R 大鼠線粒體PTP 開(kāi)放，但是當(dāng)Ca2+濃度高于60 μM 時(shí)，線粒體 PTP 開(kāi)放比例減少（圖 5）。

2.6 丙泊酚對(duì)HIF-1α 影響

I/R 損傷之后大鼠肝臟勻漿液中HIF-1α 蛋白表達(dá)增加，丙泊酚處理之后逆轉(zhuǎn)這種增加（圖6A）。HIF-1α 兩個(gè)靶基因 TfR 與 HO-1 在 I/R 損傷之后表達(dá)均上調(diào)（P 均<0.05），而丙泊酚麻醉之后卻沒(méi)有表達(dá)上調(diào)（圖6B、6C）。

3 討論

肝臟移植和主要的肝臟切除術(shù)可能導(dǎo)致急性慢性肝臟病變，可能是由于缺血再灌注損傷。低氧肝臟中細(xì)胞損傷會(huì)被血流再灌注與氧氣再次輸送加劇損傷[5]。在手術(shù)中將肝臟缺血再灌注副作用降低到最小尤為重要。因此，探索預(yù)防生物化學(xué)因子介導(dǎo)的缺血再灌注損傷的方法仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。肝臟缺血再灌注模型有助于我們了解再灌注時(shí)早期自由基釋放觸發(fā)了一系列細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞死亡[6]。線粒體最容易受到自由基攻擊，在肝臟損傷時(shí)可能導(dǎo)致功能紊亂[7]。受到破壞的線粒體可能反過(guò)來(lái)產(chǎn)生明顯的ROS，再激發(fā)一系列與肝臟缺血再灌注損傷有關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。

丙泊酚廣泛用于臨床麻醉，研究報(bào)道其對(duì)心臟、腦和下肢的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。類似地，丙泊酚也廣泛用于肝移植，因?yàn)楦嗡ソ卟粫?huì)對(duì)其代謝產(chǎn)生顯著影響。已有學(xué)者證明，吸入性麻醉藥在肝臟缺血之后可保留肝臟血流和細(xì)胞功能。目前，丙泊酚保護(hù)臟器的分子機(jī)制已有研究。Xu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚通過(guò)抑制NF-κB 激活、調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因的釋放降低缺血再灌注肝臟中AST/LDH 的水平。敲除miR-133a-5p可以抑制丙泊酚對(duì)肝臟的保護(hù)作用[10]。Ishikawa等[11]對(duì)丙泊酚和七氟醚處理的大鼠肝臟進(jìn)行Taq－Man 芯片分析，miR-378 在丙泊酚處理的大鼠肝臟中表達(dá)最高。該研究認(rèn)為miR-378 能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合UHR1 的3’UTR 區(qū)域從而啟動(dòng)髓母細(xì)胞瘤的凋亡程序[12]。但是其確切的保護(hù)機(jī)制依然不明確，參與這一過(guò)程的新的基因和蛋白還有待發(fā)現(xiàn)。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建肝臟缺血再灌注大鼠模型，擬探討丙泊酚和七氟烷兩種麻醉藥對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的作用及其可能的分子機(jī)制。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙泊酚能夠通過(guò)保護(hù)線粒體生物學(xué)功能和抑制氧化應(yīng)激來(lái)減輕肝臟損傷。七氟醚在血液中溶解度較低，在肝臟代謝能夠產(chǎn)生無(wú)機(jī)氟化物[9]。而丙泊酚化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于基于苯酚自由基清道夫例如維生素E，具有親脂性，能夠快速進(jìn)入細(xì)胞以及亞細(xì)胞膜[10]。很多研究表明丙泊酚保護(hù)作用是由于它的抗氧化作用[11-12]。我們結(jié)果表明，丙泊酚可以降低GSSG 以及GSSG/GSH 比值，這可能是通過(guò)抗氧化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。丙泊酚通過(guò)保護(hù)呼吸鏈功能與線粒體膜電位從而防護(hù)線粒體功能失調(diào)。但是丙泊酚對(duì)線粒體作用的相關(guān)研究存在爭(zhēng)議，這可能是由于不同的實(shí)驗(yàn)條件造成的。例如高劑量的丙泊酚會(huì)損傷巨噬細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[13-14]。我們結(jié)果表明，丙泊酚處理能夠減少肝臟ATP 耗散，并減少由I/R 造成的線粒體解偶聯(lián)。在肝臟缺血再灌注時(shí)，丙泊酚對(duì)線粒體功能的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放。在缺血時(shí)，PTP 關(guān)閉，再灌注時(shí)PTP 開(kāi)放導(dǎo)致膜電位耗散、ROS 產(chǎn)生過(guò)多、與ATP 耗散有關(guān)的氧化磷酸化以及細(xì)胞色素C 的釋放[15]。在肝臟缺血再灌注之后，丙泊酚調(diào)節(jié)肝臟線粒體PTP 開(kāi)放可能是通過(guò)抑制糖原合成激酶3β[16]。同時(shí)，我們還研究了丙泊酚降低肝臟缺血/再灌注損傷造成的線粒體損傷可能的分子機(jī)制。HIF-1α 是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧的主要調(diào)節(jié)因子[17]。HIF 依賴的轉(zhuǎn)鐵蛋白上調(diào)有助于ROS 產(chǎn)生以及再灌注時(shí)肝臟損傷通過(guò)鐵依賴的活性物的積累。我們研究結(jié)果表明丙泊酚可以減少肝臟中TfR 與HO-1 基因表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型也說(shuō)明HIF-1α 參與肝臟缺血再灌注，丙泊酚麻醉之后降低HIF-1α 表達(dá)。

綜上所述，丙泊酚可以降低肝臟缺血再灌注所造成的線粒體損傷，能夠保護(hù)呼吸鏈并降低ATP 損耗以及質(zhì)子漏，這種保護(hù)作用可能涉及HIF-1α 信號(hào)通路。