云南奇楠沉香茶鞣質(zhì)測定及抗氧化

劉國華，闞歡，李永霞，王代波，萬合鋒

1. 貴州省生物研究所（貴陽 550009）；2. 西南林業(yè)大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院（昆明 650224）；3. 貴州省植物園（貴陽 550004）

沉香是瑞香科沉香屬（Aquilaria）植物，是中國傳統(tǒng)的名貴藥材和天然香料，其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[1]。國產(chǎn)沉香主產(chǎn)于海南、廣東等地，進口沉香主產(chǎn)于馬來西亞、印度尼西亞、越南等國[2-4]。奇楠沉香（Aquilaria crassna）隸屬瑞香科（Thymelaceac）沉香屬（Aquilaria），分布于柬埔寨、老撾、泰國、越南等地。2004年，云南省林業(yè)技術(shù)推廣總站與西雙版納青松林業(yè)有限公司合作，從越南引種并進行培育[5]；奇楠沉香的香味會有多種變化，悠然淡雅，香味持久；現(xiàn)代科學(xué)還沒有辦法仿制其香味，是養(yǎng)生的上等香料，藥用價值高，是一種名貴藥用植物，是沉香中的上品。

沉香全身都是寶，尤其是沉香葉（白木香葉）提取物具有抗氧化、降血脂、鎮(zhèn)痛、抗癌等生理活性[6]。云南省沉香葉的資源十分豐富，每年可采二季，是沉香產(chǎn)業(yè)中值得重點開發(fā)的部分。研究表明，沉香葉乙醇回流提取物有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、促進小腸運動、瀉下、止血、抗腦缺氧、缺血、降糖、抗腫瘤作用?？蓪⒊料闳~制成茶葉或保健品，應(yīng)用于炎癥、疼痛、便秘、肥胖、出血、腦缺血、高血糖及腫瘤等相關(guān)疾病的輔助治療[7]。試驗以奇楠沉香茶葉為研究對象，測定其鞣質(zhì)含量，并進行體外抗氧化試驗，為奇楠沉香茶的藥用奠定一定的基礎(chǔ)，促進沉香茶的研究及綜合利用，同時也為緩解沉香藥材資源緊缺難題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沉香茶（西雙版納青松林業(yè)有限公司）。待測液準備：取10 g沉香茶葉并破碎成粉末，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加60 mL水，放置過夜，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置濾過，棄去30 mL初濾液，精密取20 mL續(xù)濾液，置100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。

沒食子酸、水楊酸、鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、甲醇、磷酸、鹽酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、維生素C、硫酸、DPPH等（均為分析純）。

HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；DGH-9140A數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）；Sigma 3K15高速冷凍離心機（Sigma公司）；BT-224S電子天平（Sartorius）；UV-1000紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；超聲波處理器（KQ-500DE昆山超聲儀器有限公司）；等。

1.2 試驗方法

1.2.1 奇楠沉香茶鞣質(zhì)的測定[8]

1.2.1.1 沒食子酸標準曲線的繪制

沒食子酸溶液配制參考文獻[9-10]采用Folin-Ciocalteui法，F(xiàn)C顯色劑及7.5% Na2CO3溶液配制參照文獻[11]。分別取0，50，100，150，200，250，300，350和400 μL沒食子酸溶液到刻度試管中，用蒸餾水補足到6 mL；依次加入1 mL FC顯色劑溶液、3 mL 7.5%Na2CO3溶液，搖勻，得到的沒食子酸標準溶液質(zhì)量濃度分別為0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50和4.00 μg/mL，室溫放置顯色2 h；在765 nm波長下測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，對應(yīng)吸光度為縱坐標建立標準曲線。

1.2.1.2 總酚含量的測定

分別吸取50 μL待測樣品液到刻度試管中，用蒸餾水補足到6 mL，按順序加入1 mL FC顯色劑溶液、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫放置顯色2 h，在765 nm波長下測定吸光度。由標準曲線求得對應(yīng)的總酚質(zhì)量濃度，以沒食子酸計。

1.2.1.3 不被吸附多酚的測定

取25 mL待測樣品液，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h并振搖，取出后放冷過濾并棄去初濾液，取10 mL續(xù)濾液，置25 mL棕色量瓶中。分別吸取50 μL續(xù)濾液到刻度試管中，用蒸餾水補足到6 mL，按順序加入1 mL FC顯色劑溶液、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫放置顯色2 h，在765 nm波長下測定吸光度。由標準曲線求得對應(yīng)的不被吸附多酚質(zhì)量濃度，以沒食子酸計。

1.2.1.4 鞣質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的計算[8,12]

鞣質(zhì)質(zhì)量（總酚質(zhì)量與不被吸附多酚質(zhì)量之差）與沉香葉質(zhì)量的比值計算鞣質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，如表1所示。

1.2.2 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)清除羥自由基的能力

依次取2.0 mL 9 mmol/L的FeSO4，2.0 mL 8.82 mmol/L雙氧水，2.0 mL 9 mmol/L的水楊酸溶液于25 mL容量瓶中，向反應(yīng)體系中分別加入1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL提取液或VC待測液，用蒸餾水定容，搖勻，恒溫37 ℃。在510 nm測其吸光度為A1，按此方法不加提取液或VC待測液吸光度為A0，按照此方法不加雙氧水測定的吸光度為。

式中：A1為加入待測物后吸光度；At為待測物吸光度；A0為空白對照的吸光度。

1.2.3 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)抑制超氧陰離子自由基的能力

以改良鄰苯三酚自氧化的速率來表示抑制超氧陰離子自由基的能力[15]。

加入樣品前：將pH 8.2 Tris-HCl緩沖液和50 mmol/L鄰苯三酚在25 ℃的恒溫水浴鍋中保溫，取5 mL pH 8.2 Tris-HCl緩沖液，加30 μL 50 mmol/L鄰苯三酚，搖勻，在325 nm下立即測定。以pH 8.2 Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5 min測1次吸光度，計算出平均值A(chǔ)0。

加入樣品后，取5 mL pH 8.2 Tris-HCl緩沖液，加5～60 μL待測樣品、30 μL 50 mmol/L鄰苯三酚，搖勻，立即同上測定。以pH 8.2 Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5 min測1次吸光度，計算出平均值A(chǔ)1。按照加入樣品的方法測出不加入鄰苯三酚的吸光度，計算出平均值A(chǔ)t。

式中：A1為加入待測物后吸光度；At為待測物的吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.2.4 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力

1.2.4.1 DPPH標準曲線的繪制[16-17]

精密稱取0.020 2 g DPPH，加甲醇溶解，定容至50 mL，作為儲備液。精密移取10 mL儲備液至100 mL量瓶中，定容得40.4 mg/L儲備液，備用。分別精密移取0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL DPPH儲備液于10 mL刻度試管中，用甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇溶劑作參比，在515 nm處測定各溶液的吸光度。以DPPH的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 沉香茶中多酚類物質(zhì)及抗壞血酸（VC）清除DPPH自由基的能力

測定方法見參考文獻[17-18]，稍作修改。分別在1.0 mL DPPH儲備液中加入不同體積（5～160 μL）沉香茶樣品待測液或VC溶液，用甲醇稀釋至總體積3.00 mL，混勻放置40 min后，用比色皿于515 nm處測定吸光度A1；用同樣操作步驟不加DPPH儲備液測出沉香液在不同體積數(shù)下的吸光度At；由（A1-At）吸光度再根據(jù)DPPH標準曲線回歸方程計算DPPH質(zhì)量濃度，按式（3）計算DPPH清除率（Y）。

式中：C0為反應(yīng)體系中DPPH的起始質(zhì)量濃度，mg/L；Ct為40 min后反應(yīng)體系中DPPH的質(zhì)量濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 奇楠沉香茶鞣質(zhì)含量的測定

2.1.1 沒食子酸標準曲線

以吸光度（y）對沒食子酸質(zhì)量濃度（x）回歸，得到回歸方程y=0.108 7x+0.003 1，所得沒食子酸標準曲線如圖1所示。

2.1.2 鞣質(zhì)含量

以鞣質(zhì)質(zhì)量（總酚質(zhì)量與不被吸附的多酚質(zhì)量之差）與沉香葉質(zhì)量的比值計算鞣質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，見表1。

結(jié)果表明，奇楠沉香葉總酚含量僅0.017 1%；不被吸附多酚含量為0.015 9%；鞣質(zhì)含量為0.001 2%。林芳花等[19]從廣東省茂名市電白縣沉香規(guī)范化種植基地沉香葉中測得鞣質(zhì)含量為1.41%，這與試驗測得的結(jié)果相差很大，原因可能是地方差異導(dǎo)致其含量相差很大，也有可能是試驗提取不充分導(dǎo)致只有很低的鞣質(zhì)含量。此外也說明沉香茶中含有的總酚與不被吸附多酚含量相差不大。

圖1 沒食子酸標準曲線

表1 鞣質(zhì)含量

2.2 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)清除羥自由基的能力

依據(jù)Fenton反應(yīng)體系建立的清除羥自由基能力，其結(jié)果如圖2所示。

隨著反應(yīng)體系中沉香葉提取液增加，其清除羥自由基的能力逐漸增強。沉香茶提取液中多酚量0.412 μg/mL時，清除率最大，達到39.2%。但是其清除羥自由基的能力遠不及VC。因此，云南西雙版納奇楠沉香茶提取液對羥自由基清除能力較弱，間接說明沉香茶中多酚類物質(zhì)含量較低。

圖2 清除羥自由基能力對比

2.3 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)抑制超氧陰離子能力

沉香茶多酚類物質(zhì)與VC抑制超氧陰離子能力對比如圖3所示。

沉香茶提取液中多酚類物質(zhì)與VC一樣，均具有一定抑制超氧陰離子自由基能力。隨著提取液添加量增加，抑制超氧陰離子自由基能力不斷加強，沉香葉提取液加入量0.14 mL時，沉香茶中的多酚抑制率達67.8%，與同等VC加入量的抑制效果相當(dāng)。結(jié)果表明，云南西雙版納奇楠沉香茶提取液有抑制超氧陰離子自由基的能力，且到達一定量時效果顯著。由此推斷云南西雙版納奇楠沉香茶提取物有良好的體外抗氧化能力。

圖3 抑制超氧陰離子能力對比

2.4 奇楠沉香茶中多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力

2.4.1 DPPH標準曲線的繪制

配制DPPH標準溶液系列，繪制DPPH標準曲線，見圖4。標準曲線線性回歸方程為y=0.158 3x-0.004 0。

2.4.2 沉香茶中多酚類物質(zhì)與VC清除DPPH自由基的能力

根據(jù)標準曲線，沉香茶中多酚類物質(zhì)與VC清除DPPH自由基能力見圖5。

隨著反應(yīng)體系中加入沉香葉提取物體積增多，其清除DPPH自由基的能力也加強，多酚含量0.091 μg/mL時清除能力達到最高水平，清除率達91.5%。與VC清除能力對比結(jié)果表明，在濃度很小時，VC清除DPPH自由基能力很強，而沉香茶中多酚類物質(zhì)很低，當(dāng)向溶液中加入一定量沉香茶待測液時，清除率有明顯增大趨勢，到一定量時，沉香茶待測液中多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力接近VC，說明沉香茶中的多酚類物質(zhì)有一定抗氧化能力，到一定程度時抗氧化能力良好。

圖4 DPPH標準曲線

圖5 清除DPPH自由基能力對比

3 結(jié)論

研究表明，用蒸餾水浸泡過夜后，經(jīng)過超聲處理提取沉香茶中的多酚類物質(zhì)量相對較少，導(dǎo)致測出的鞣質(zhì)含量較低。沉香茶中的多酚類物質(zhì)總抗氧化的能力隨加入量愈多，抗氧化能力愈強及清除羥自由基的作用愈強，并用VC進行對照，說明沉香茶中多酚類物質(zhì)具有一定抗氧化及清除羥自由基能力；進一步采用DPPH法對沉香茶中多酚類物質(zhì)進行體外抗氧化活性研究，與VC進行對比，更能說明沉香茶中多酚類物質(zhì)具有抗氧化能力，但抗氧化能力相對于VC較差。試驗結(jié)果為研究沉香茶的具體抗氧化性質(zhì)提供基礎(chǔ)。