環(huán)境DNA技術(shù)在生態(tài)保護和監(jiān)測中的應(yīng)用

張 輝 , 線薇薇

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

生物多樣性是全人類最終所依賴的所有尺度上生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)的最初支撐者, 也是人類生存和發(fā)展的基礎(chǔ), 它與“全球變遷”和“持續(xù)發(fā)展”同被列為當(dāng)代生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)的三大前瞻性領(lǐng)域[1]。近一個世紀(jì)以來, 隨著人類活動的不斷加劇, 生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)遭到了嚴(yán)重的破壞, 物種滅絕的速度不斷加快, 人類賴以生存的生態(tài)系統(tǒng)中 60%已處于持續(xù)退化狀態(tài), 自然資源的三分之二已被損耗, 生物多樣性減少、生態(tài)系統(tǒng)功能退化、全球氣候變化等早已成為全球性的重大問題[2]。

基于此背景, 在避免對當(dāng)前生態(tài)環(huán)境再破壞的前提下, 開展全面準(zhǔn)確的生態(tài)監(jiān)測來查清和明確生物多樣性, 對生態(tài)保護和可持續(xù)利用具有極其重要的意義。環(huán)境DNA技術(shù)(eDNA)的發(fā)展就提供了一種生態(tài)和生物多樣性監(jiān)測監(jiān)測的新手段。該技術(shù)樣品采集簡單易行, 是一種便捷地、環(huán)境友好型地大范圍生態(tài)監(jiān)測技術(shù)。

eDNA, 是指環(huán)境中存在的 DNA, 在大型生物研究中主要指生物脫落在環(huán)境中的組織或者細(xì)胞內(nèi)含有的 DNA, 例如皮毛、黏膜、糞便等[3]。通過采集 eDNA樣品, 基于測序技術(shù)(現(xiàn)在通常使用第二代測序技術(shù), 即高通量測序)監(jiān)測調(diào)查區(qū)域的生物種類,稱為環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)(圖1)。

圖1 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)——以海洋魚類為例Fig. 1 Workflow of eDNA metabarcoding in the research on marine fishes

1 環(huán)境DNA技術(shù)的發(fā)展

eDNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)中應(yīng)用的靈感, 來自于 20世紀(jì) 90年代利用潛水采集到的糞便來識別座頭鯨(Megaptera novaeangliae), 抹香鯨(Physeter macrocephalus)及露脊鯨(Eubalaena glacialis)等的相關(guān)研究中[3]。而世界上首例證明eDNA適用于水生生態(tài)系統(tǒng)的研究是2008年Ficetola 等對美國牛蛙入侵的報道[4]。該研究表明即使目標(biāo)水域內(nèi)的牛蛙數(shù)量很少(例如每平方公里水域僅有1～2只牛蛙), 亦可通過eDNA將該物種檢測出來。

此后, 一些對不同水環(huán)境、不同生物門類的研究均驗證了eDNA在物種檢測中的有效性和靈敏性。例如, 美國水產(chǎn)生物保護中心進行的一項大型研究開發(fā)了在大湖系統(tǒng)的運河中檢測白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(H.nobilis)等物種的 eDNA 技術(shù)[5]。Goldberg等通過測試多種DNA提取和PCR方法完善了eDNA技術(shù), 以檢測源頭水流中的蠑螈(Dicamptodon aterrimus)和尾蟾落基山亞種(Ascaphus montanus)[6]。Thomsen等[7]表明基于eDNA技術(shù)對于甲殼動物、水生昆蟲、水生哺乳動物以及鳥類和陸生哺乳動物等的監(jiān)測是有效的。2012年以來, 利用eDNA檢測脊椎動物的論文大量增加, 其中包括綜述論文, 如“環(huán)境DNA生態(tài)學(xué)研究及其在保護遺傳學(xué)中的應(yīng)用”[8], “基于eDNA的野生生物及生物多樣性監(jiān)測”[9]和“基于eDNA對水生動物的監(jiān)測——生態(tài)學(xué)研究中 eDNA作為調(diào)查工具的綜述”[10]以及生物保護集刊《環(huán)境DNA： 生物保護的高效新工具》中的12篇研究論文對eDNA在生物保護學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進行了報道等等[11]。這些研究為 eDNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng), 尤其是海洋生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測中的應(yīng)用奠定了必要的基礎(chǔ)(圖2)。

圖 2 環(huán)境DNA研究發(fā)展概略圖Fig. 2 Overview of the research history of eDNA

2 國際上環(huán)境DNA技術(shù)在生態(tài)監(jiān)測中的應(yīng)用

國際上相關(guān)研究驗證了 eDNA技術(shù)在生態(tài)監(jiān)測中的有效性和靈敏性。Bálint 等[12]綜述了最近的研究成果, 強調(diào) eDNA為生態(tài)研究提供了強有力的新時態(tài)數(shù)據(jù)來源, 并討論了基于 eDNA技術(shù)的潛在研究方向, 概述了相關(guān)挑戰(zhàn)?！?018研究前沿》[13]顯示在生態(tài)與環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域, eDNA技術(shù)監(jiān)測生物多樣性連續(xù)第2年入選熱點研究前沿(圖3)。本研究主要對eDNA技術(shù)在生態(tài)監(jiān)測中的幾個主要方向進行介紹。

圖3 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域Top10 熱點前沿的施引論文Fig. 3 Top 10 research topics in the fields of ecology and environment science注： 改編自《2018研究前沿》[13]

2.1 環(huán)境 DNA技術(shù)與傳統(tǒng)監(jiān)測方法的互補性

野生生物資源調(diào)查通常使用網(wǎng)具進行, 這在監(jiān)測高豐度物種時較為可靠, 而對低豐度、珍惜、瀕危物種的捕獲概率較低, 隨著野生生物資源不斷減少,傳統(tǒng)資源調(diào)查得到的結(jié)果會存在較大誤差[14]。研究表明, eDNA方法比傳統(tǒng)的調(diào)查方法更為靈敏、有效。Dejean等[15]在外來物種入侵研究中, 以兩種美國牛蛙為研究對象, 將傳統(tǒng)調(diào)查方法與 eDNA技術(shù)進行了比較, 結(jié)果表明 eDNA技術(shù)更加便捷有效。Davy等[16]利用 eDNA方法對 8種淡水龜進行了監(jiān)測, 結(jié)果表明 eDNA方法在龜類資源調(diào)查和監(jiān)測中具有適用性, 可以推廣至瀕危龜類物種的監(jiān)測等領(lǐng)域。Sigsgaard等[17]在丹麥水域同時使用傳統(tǒng)調(diào)查方法和eDNA技術(shù)對泥鰍進行了監(jiān)測, 結(jié)果表明eDNA方法結(jié)果可靠, 且所需成本較小。Smart等[18]認(rèn)為eDNA方法比傳統(tǒng)方法在水生生物分類領(lǐng)域更高效, 并就優(yōu)化eDNA的成本進行了探索。Evans等[19]以美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)為研究對象比較了電擊法和 eDNA方法的優(yōu)劣, 表明 eDNA方法更加省時省力, 約能節(jié)省67%的成本, 因此eDNA可以成為電擊法調(diào)查的有力補充。

2.2 基于環(huán)境 DNA技術(shù)監(jiān)測物種生活史過程

由于 eDNA技術(shù)對目標(biāo)物種的干擾和生態(tài)系統(tǒng)的破壞性較小, 因此可用于監(jiān)測不同門類的物種,如日本大鯢(Andrias japonicus)[20]、泥鰍(Misgurnus fossilis)[21]、阿拉巴馬鱘(Scaphirhynchus suttkusi)[22]等。相關(guān)研究進一步表明, 通過監(jiān)測eDNA濃度的變化, 可以實現(xiàn)對目標(biāo)物種在特定區(qū)域的產(chǎn)卵場、索餌場及遷移路徑等生活史過程的監(jiān)測和預(yù)測, 顯著提高了生態(tài)監(jiān)測的效率, 同時降低了大量人工成本和科研成本。Spear等[23]利用 eDNA對隱鰓鯢(Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis)進行資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)在隱鰓鯢的繁殖期, 其 eDNA濃度處于最高值。Erickson等[24]基于 eDNA方法研究了鳙魚入侵的遷移路徑、產(chǎn)卵場位置, 發(fā)現(xiàn)了eDNA濃度與其遷移路徑的相關(guān)性。Buxton等[25]研究發(fā)現(xiàn)在疣螈(Triturus cristatus)繁殖期(6月開始)及稚魚期(8月中旬開始)水域中的eDNA濃度最高。Bylemans等[26]證明eDNA濃度變化可以作為監(jiān)測瀕危物種澳洲麥?zhǔn)削|(Macquaria australasica)產(chǎn)卵行為的重要手段, 并有望在其他門類物種產(chǎn)卵過程中推廣使用。

2.3 基于環(huán)境DNA技術(shù)推算物種豐度

研究表明, 基于 eDNA濃度與物種生物量之間的正相關(guān)關(guān)系可以確定物種的豐度和區(qū)系分布。Pilliod等[27]在美國愛達(dá)荷州的13條河流中利用傳統(tǒng)野外調(diào)查方法和 eDNA方法采集了樣品進行比較研究, 結(jié)果表明 eDNA濃度與野外調(diào)查得到的生物密度、生物量等結(jié)果呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Evans等[28]測定了9種動物(包括8種淡水魚類和1種兩棲動物)的 6個線粒體基因片段序列, 發(fā)現(xiàn)序列拷貝數(shù)與上述9種生物的豐度存在正相關(guān)關(guān)系, 提示eDNA具有生物豐度評價指標(biāo)的潛力。Lacoursiere-Roussel等[29]認(rèn)為關(guān)于 eDNA濃度與物種豐度之間關(guān)系的大量例證使得eDNA在漁業(yè)評估管理中具有廣泛應(yīng)用前景。Doi等[30]基于日本佐波河水域浮潛調(diào)查研究, 證明了香魚(Plecoglossus altivelis)eDNA濃度與其豐度及生物量的關(guān)系, 結(jié)果表明 eDNA分析是估算魚類豐度/生物量以及它們在河流中的空間分布的有效工具。Salter等[31]比較了基于eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)拖網(wǎng)調(diào)查結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)大西洋鱈魚(Gadus morhua)的捕獲量與定量PCR結(jié)果呈顯著正相關(guān)關(guān)系, 提出eDNA技術(shù)可以用于重要海洋經(jīng)濟魚類的區(qū)域性資源量評估。

2.4 基于環(huán)境DNA技術(shù)研究生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化

生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化是生態(tài)監(jiān)測的重要方面, 通過 eDNA分析, 可以同時監(jiān)測生物在多個營養(yǎng)級和群落中的動態(tài)變化, 從而提供與生態(tài)系統(tǒng)變化相關(guān)的生物間作用的關(guān)鍵信息。Djurhuus等[32]利用eDNA高通量測序技術(shù), 基于加利福尼亞蒙特雷灣18個月(2015—2016年)的海水樣品, 研究了該生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性, 推斷了群落結(jié)構(gòu)變化及其與環(huán)境的關(guān)系, 提供了預(yù)期的捕食者與被捕食者之間的關(guān)系、營養(yǎng)級關(guān)系及季節(jié)性變化的證據(jù), 認(rèn)為基于 eDNA分析可以掌握海洋生態(tài)系統(tǒng)變化并為保護敏感生物提供依據(jù)。Holman等[33]基于eDNA調(diào)查了英國沿海4個碼頭的沉積物和水樣, 并與歷史結(jié)果進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了含多個新引進種在內(nèi)的多個非本地種, 凸顯了 eDNA宏條形碼技術(shù)在非本地種早期檢測和時空監(jiān)測中的實用性, 認(rèn)為在是評估群落結(jié)構(gòu)變化相關(guān)研究時需選擇不同類型的環(huán)境樣本。Sigsgaard等[34]在丹麥沿海進行了為期一年的水樣采集和浮潛觀察, 基于eDNA技術(shù)分析了水樣品, 并與已有的 7年歷史數(shù)據(jù)進行了比較。結(jié)果證明 eDNA鑒定的OTUs隨魚類群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化而變化。盡管浮潛觀察結(jié)果與 eDNA結(jié)果存在差異, 但是通過浮潛觀察到的的絕大多數(shù)魚類都可以在 eDNA結(jié)果中獲得, 該研究證明了 eDNA在重建海水魚類群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化中至關(guān)重要。

3 我國環(huán)境DNA技術(shù)在生態(tài)監(jiān)測中的應(yīng)用

國內(nèi)學(xué)者近年來亦開展了 eDNA相關(guān)研究, 但總體仍處于起步狀態(tài), 且大部分聚焦于淡水生態(tài)系統(tǒng), 對海洋生態(tài)系統(tǒng)的研究報道較少。

徐浩等[35]、陳煉等[36]、趙明等[37]通過綜述介紹了環(huán)境DNA技術(shù)在生物多樣性和生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。姜維等[38]以川陜哲羅鮭為目標(biāo)物種, 對環(huán)境DNA 分析流程進行了設(shè)計優(yōu)化; 劉軍等[39]對魚類環(huán)境DNA 研究中的通用引物進行了篩選驗證。徐念和常劍波[40]基于長江中下游干流環(huán)境 DNA樣本, 開展了魚類物種檢測的相關(guān)工作, 該研究從來源于 17 個采樣點的115條匹配成功的序列中檢測出了15 種魚類。孫晶瑩等[41]研究表明 eDNA 宏條形碼技術(shù)可實現(xiàn)對浮游動物物種的半定量檢測, 在生物多樣性監(jiān)測和生物完整性評價有顯著的應(yīng)用價值。李苗等[42]建立了一套中國對蝦 eDNA 技術(shù)的操作流程, 提高了中國對蝦的檢出率。Zhang等[43]基于eDNA技術(shù)研究了長江口及其鄰近水域魚類群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化特征。結(jié)果顯示： eDNA技術(shù)適用于長江口及其鄰近水域的資源監(jiān)測, 與傳統(tǒng)方法相比更加靈敏和有效。張輝和線薇薇開發(fā)了一種收集海水中環(huán)境DNA的裝置[44]。陳治等[45]以曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)為研究對象, 通過絕對定量技術(shù)建立和優(yōu)化了舟山近海高濁度水樣 eDNA的獲取方法, 建立了舟山近海水樣大生物 eDNA最適獲取方法, 為相似水域的水樣采集及eDNA提取提供了借鑒參考。

4 結(jié)論與展望

eDNA技術(shù)的優(yōu)勢使其能夠作為傳統(tǒng)資源調(diào)查的有力補充, 在生態(tài)保護和監(jiān)測中能夠發(fā)揮重要作用, 已在美國、日本等發(fā)達(dá)國家廣泛應(yīng)用。我國的相關(guān)研究, 尤其是在海洋領(lǐng)域的研究十分匱乏, 亦應(yīng)當(dāng)穩(wěn)步開展、不斷加強, 充分發(fā)揮eDNA技術(shù)的優(yōu)勢服務(wù)于生態(tài)保護。

需要指出的是, 任何技術(shù)的發(fā)展都會存在一系列挑戰(zhàn)。在eDNA技術(shù)研究中, 亦存在一些問題。例如, 在海洋監(jiān)測中, 海水樣品高質(zhì)量保存與提取難度大; 野外現(xiàn)場水樣品容易被污染; 不同門類選擇的通用引物尚沒有統(tǒng)一認(rèn)識; 在鑒定OUTs時往往依賴于相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的已有序列, 而當(dāng)數(shù)據(jù)庫中不存在該物種的相關(guān)信息或者信息存在錯誤時, 物種鑒定結(jié)果就不準(zhǔn)確; 雖然有大量研究嘗試了基于qPCR產(chǎn)物濃度或者 PCR序列數(shù)量來推測生物量, 但基于eDNA技術(shù)計算生物量不僅流程復(fù)雜, 而且其結(jié)果與實際情況通常存在較大差距等等, 這些都是亟需科學(xué)工作者努力解決的問題。