和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3及其抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

（.海南省三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 三亞 57000；.海南省三亞市人民醫(yī)院血液凈化中心，海南 三亞 57000；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 50400）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見并發(fā)癥之一，末期通常會發(fā)展至慢性腎功能衰竭[1]。高血糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cell，GMC）凋亡和缺失，是糖尿病腎病的主要原因[2]。和厚樸酚（honokiol）是從木蘭屬植物中分離的一種小分子多酚，具有抗血管生成、抗炎、抗腫瘤的特性，且沒有明顯的毒性[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚對炎癥引起小鼠GMC的凋亡具有潛在的抑制作用[5]。研究[6]表明，微小RNA-155（micro RNA-155，miR-155）廣泛參與機(jī)體的多種病理生理功能，特別在DN腎組織和高糖誘導(dǎo)的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[7]。Smad家族蛋白是一類重要的信號傳導(dǎo)蛋白，在人體多種組織中表達(dá)并參與細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，但研究發(fā)現(xiàn)其在腎損傷組織中表達(dá)異常[8-11]。但是在高糖誘導(dǎo)的GMC中，miR-155和Smad3的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究以高糖誘導(dǎo)GMC產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡為模型，探索和厚樸酚對高糖誘導(dǎo)GMC凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎小球系膜細(xì)胞系SV40-MES-13（American type culture collection，ATCC細(xì)胞庫）；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司）、胰蛋白酶Trypsin（Gibco公司）；和厚樸酚（Sigma-Aldrich公司）；抗Smad3抗體和抗β-actin抗體（Abcam公司）；總RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；顯微鏡、Real-time PCR儀（美國Bio-Rad公司）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SV40-MES-13細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合為一層時，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用Trypsin消化傳代。

實(shí)驗(yàn)分組具體如下：空白組：培養(yǎng)基中加入D-葡萄糖5 mmol·L-1；高糖組：培養(yǎng)基中加入D-葡萄糖30 mmol·L-1；高糖+和厚樸酚組：D-葡萄糖30 mmol·L-1+和厚樸酚40 μg·mL-1。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待SV40-MES-13細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以每孔約2×105個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞基本融合為一層時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行操作，將miR-con、miR-155、anti-miR-con、anti-miR-155、WT-Smad3+miR-con、WT-Smad3+miR-155、MUTSmad3+miR-con和MUT-Smad3+miR-155等載體用無血清培養(yǎng)基稀釋，取等體積脂質(zhì)體和各組載體混合靜置20 min，將混合液加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h，換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá) 收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、82 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA于- 80℃保存。取cDNA按照real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。miR-155上游引物5’-TTAATGCTAATCGTGATAGG-3’，下游引物為試劑盒內(nèi)通用引物；Smad3上游引物5’-GAGAGGTGTGCGGCTCTACT-3’，下游引物5’-CTGGTTGCAGTTGGGAGACT-3’；β-actin上游引物5’-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3’，下游引物5’-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3’。運(yùn)用Bio-Rad PCR系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，內(nèi)參參照β-actin。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 經(jīng)葡萄糖和/或和厚樸酚處理后，各組細(xì)胞以約2×104個/孔接種于6孔板中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄培養(yǎng)液，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，重懸細(xì)胞，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液，超聲破碎，收集蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入稀釋的一抗（抗Smad3抗體和抗β-actin抗體），4 ℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的二抗室溫孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 用Trypsin消化轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，將其接種于24孔板中，接種密度1×104個細(xì)胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80% -90%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建Smad3的野生型（WT-Smad3）和突變型（MUT-Smad3）雙熒光素酶報(bào)告載體，然后分別共轉(zhuǎn)染miR-con或miR-155，48 h后收集細(xì)胞，用裂解液室溫裂解20 min，收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對高糖誘導(dǎo)的GMC中miR-155和Smad3表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，高糖組GMC中miR-155表達(dá)量顯著下降（P＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜ 0.05）；與高糖組相比，高糖組+和厚樸酚組的細(xì)胞中，miR-155表達(dá)量顯著上升（P ＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降（P ＜ 0.05），見表1。結(jié)果表明高糖誘導(dǎo)的GMC中miR-155表達(dá)下調(diào)，Smad3表達(dá)上調(diào)，而和厚樸酚逆轉(zhuǎn)了高糖對GMC中miR-155和Smad3表達(dá)的影響。

2.2 過表達(dá)miR-155抑制高糖誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞凋亡

qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與高糖+miR-con組相比，高糖+miR-155組的miR-155表達(dá)量顯著上升（P ＜ 0.05），細(xì)胞凋亡率顯著下降（P ＜ 0.05），見表2。結(jié)果表明過表達(dá)miR-155可抑制高糖誘導(dǎo)GMC的凋亡作用。

表1 和厚樸酚對高糖誘導(dǎo)GMC中miR-155和Smad3表達(dá)的影響. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表1 和厚樸酚對高糖誘導(dǎo)GMC中miR-155和Smad3表達(dá)的影響. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與空白組相比較，*P ＜ 0.05；與高糖組相比較，#P ＜ 0.05Note：compared with the blank group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose group, #P ＜ 0.05

組別 miR-155 Smad3 mRNA Smad3 蛋白空白組 1.76± 0.35 1.28±0.29 0.56±0.07高糖組 0.48±0.11* 4.86±0.81* 1.27±0.14*高糖+和厚樸酚組 1.94±0.49# 1.46±0.35# 0.62±0.08#F 15.222 42.440 45.155 P 0.005 0.000 0.000

表2 過表達(dá)miR-155對高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表2 過表達(dá)miR-155對高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖+miR-con組比較，*P ＜ 0.0Note：compared with the high glucose + miR-con group, *P ＜ 0.05

組別 miR-155 凋亡率/%高糖組 0.46±0.07 32.27±2.59高糖+miR-con組 0.42±0.08 33.86±2.93高糖+ miR-155組 2.43±0.17* 17.72±1.45*F 295.619 40.936 P 0.000 0.000

2.3 miR-155靶向調(diào)控Smad3的表達(dá)

Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，Smad3的3’UTR序列中含有與miR-155互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖1。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表3所示，與miR-con組相比，miR-155組野生型WT-Smad3的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降（P ＜ 0.05），而突變型MUTSmad3的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化，說明miR-155與Smad3具有相互作用。Western blot結(jié)果表明，與miR-con組相比，miR-155組的Smad3蛋白表達(dá)量顯著下降（P ＜ 0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-155組的Smad3蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜ 0.05），見表4，說明miR-155靶向負(fù)調(diào)控Smad3的表達(dá)。

2.4 沉默Smad3抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與高糖+si-con組相比，高糖組+si-Smad3組的細(xì)胞中Smad3表達(dá)量顯著下降（P ＜ 0.05），細(xì)胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05），見表5。說明沉默Smad3可抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡。

圖1 Targetscan對miR-155和Smad3 mRNA核苷酸序列的預(yù)測結(jié)果Fig 1 Targetscan's prediction of miR-155 and Smad3 mRNA nucleotide sequences

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

注：與miR-con組比較，*P ＜ 0.05Note： compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05

組別 WT- Smad3 MUT- Smad3 miR-con 1.00±0.07 0.95±0.09 miR-155 0.39±0.07* 0.98±0.11 t 10.673 0.366 P 0.000 0.733

表4 miR-155靶向調(diào)控Smad3的表達(dá). ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

表4 miR-155靶向調(diào)控Smad3的表達(dá). ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

注：與miR-con組比較，*P ＜ 0.05；與anti-miR-con組比較，#P ＜ 0.05 Note：compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05； compared with the anti-miR-con group, #P ＜ 0.05

組別 Smad3 miR-con 0.59±0.06 miR-155 0.18±0.05*anti-miR-con 0.54±0.05 anti-miR-155 1.35±0.11#F 140.232 P 0.000

2.5 和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果結(jié)果顯示，與高糖組相比，高糖+和厚樸酚組的Smad3表達(dá)量顯著下降（P ＜ 0.05），細(xì)胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05）。采用siRNA敲低方法分別敲低miR-155和Smad，發(fā)現(xiàn)與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組相比，高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155組的Smad3表達(dá)量顯著上升（P ＜ 0.05），細(xì)胞凋亡率也顯著上升（P＜ 0.05）；與高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155+si-con組相比，高糖+和厚樸酚+ anti-miR-155+ si-Smad3組Smad3表達(dá)量顯著下降（P ＜ 0.05），細(xì)胞凋亡率也顯著下降（P ＜ 0.05），見表6。

表5 沉默Smad3抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表5 沉默Smad3抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖+si-con組比較，*P ＜ 0.05Note：compared with the high glucose+si-con group, *P ＜ 0.05

組別 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖組 4.66±0.57 1.16±0.13 31.38±2.74高糖+si-con組 4.54±0.61 1.22±0.14 32.48±2.35高糖+si-Smad3組 0.88±0.12* 0.47±0.07* 14.72±1.61*F 58.403 37.761 57.052 P 0.000 0.000 0.000

表6 和厚樸酚抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表6 和厚樸酚抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：與高糖組比較，*P ＜ 0.05；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組比較，#P ＜ 0.05；與高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con組比較，&P ＜ 0.05Note: compared with the high glucose group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-con group, #P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-155+si-con group, &P ＜ 0.05

組別 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖組 4.73±0.62 1.23±0.11 32.02±2.43高糖+和厚樸酚組 1.51±0.41* 0.48±0.06*16.59±2.28*高糖+和厚樸酚+anti-miR-con組1.58±0.44 0.58±0.07 14.72±1.79高糖+和厚樸酚+anti-miR-155組3.95±0.57# 1.09±0.09#28.37±2.17#高糖+和厚樸酚+anti-miR-155+si-con組3.76±0.53 1.04±0.13 29.54±2.94高糖+和厚樸酚+ antimiR-155+ si-Smad3組1.78±0.48& 0.63±0.09&15.20±1.15&F 23.021 33.244 40.127 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，糖尿病發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重危害患者生命健康[12-13]。糖尿病通常引發(fā)糖尿病腎病，高血糖會導(dǎo)致GMC脫落和凋亡，最終導(dǎo)致腎小球硬化，腎功能衰竭[14-15]。然而，當(dāng)前其發(fā)病機(jī)制未完全闡明、治療效果仍不滿意。

既往研究表明，和厚樸酚能夠通過抑制促炎因子，改善腎纖維化[16]。王葉萍等[17]研究證實(shí)，和厚樸酚能有效抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人GMC炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕腎損傷。房云崗等[18]研究表明，和厚樸酚可能通過抑制氧化應(yīng)激及減輕炎癥反應(yīng)，抑制由線粒體誘導(dǎo)的凋亡途徑而緩解腎臟缺血再灌注損傷。本研究證實(shí)，和厚樸酚可以抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡，與之前和厚樸酚保護(hù)腎組織細(xì)胞的研究結(jié)果相似。

miR-155是miRNA家族中典型的多功能miRNA，與細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)[19]。Beltrami等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在糖尿病腎病患者的腎小球和遠(yuǎn)端、近端小管中表達(dá)異常。本研究結(jié)果表明，在高糖誘導(dǎo)的GMC中：miR-155表達(dá)下調(diào)，加入和厚樸酚后可促進(jìn)miR-155的表達(dá)并減少GMC凋亡；下調(diào)miR-155則可逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對GMC凋亡的抑制作用，說明和厚樸酚通過促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的GMC中miR-155的表達(dá)抑制GMC凋亡。

Smad3是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）的下游信號分子，參與細(xì)胞凋亡、增殖、干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等多個生物過程[21]。研究表明，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中，Smad3磷酸化水平升高，細(xì)胞凋亡水平升高，下調(diào)Smad3可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Smad3在高糖誘導(dǎo)的GMC中表達(dá)上調(diào)；和厚樸酚可抑制Smad3的表達(dá)；沉默Smad3可抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡，說明和厚樸酚通過抑制Smad3抑制GMC凋亡，與上述結(jié)果類似。

Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad3的3’UTR序列中含有與miR-155互補(bǔ)的核苷酸序列，暗示兩者之間可能存在結(jié)合位點(diǎn)或調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明，miR-155靶向負(fù)調(diào)控Smad3的表達(dá)，抑制Smad3表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-155下調(diào)對GMC產(chǎn)生的影響。由此說明和厚樸酚通過miR-155靶向抑制Smad3表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的GMC凋亡，證實(shí)了在GMC中miR-155與Smad3之間具有調(diào)控關(guān)系。

本研究證實(shí)，在高糖誘導(dǎo)的GMC中，和厚樸酚通過促進(jìn)miR-155表達(dá)，靶向抑制Smad3表達(dá)，進(jìn)而抑制GMC凋亡、減輕高糖誘導(dǎo)的GMC損傷，為和厚樸酚治療糖尿病腎病提供了理論和實(shí)驗(yàn)支持。