超聲協(xié)同次氯酸鈉殺滅腐敗菌效果與動力學(xué)研究

遲 媛 弓 敏 馬艷秋 遲玉杰

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

食品原材料的清洗殺菌是食品加工中必不可少的環(huán)節(jié)，采用有效的殺菌方法可殺滅腐敗菌和致病菌，以保證食品質(zhì)量安全。存在于食品中的微生物種類繁雜，其中大腸埃希氏菌是食品中重要的腐生菌，能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，造成食品腐敗變質(zhì)，而且大腸桿菌產(chǎn)生的腸毒素、外毒素、志賀毒素、黏附素等致病物質(zhì)會增加人體患病風(fēng)險[1-2]；芽孢桿菌屬已被證實為多種食品中常見的食品腐敗菌，其中枯草芽孢桿菌可分解食品中蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，造成食品的風(fēng)味和口感產(chǎn)生不期望的變化，從而引起食品的腐敗變質(zhì)[3]；考克氏菌廣泛存在于海洋食品、腐乳、肉類等蛋白質(zhì)含量高的產(chǎn)品中，同樣極易造成食品的變質(zhì)[4]。因此，對食品中典型腐敗菌種進行有效的殺滅是保證產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵所在。

化學(xué)殺菌劑殺菌操作簡便、成本低，目前國外食品加工企業(yè)一般采用次氯酸鈉殺菌劑對蛋源進行殺菌處理，但是其單獨作用于菌體細胞時，滲透性較差，對菌體僅造成亞致死損傷，殺菌效果差[5]。超聲作為一種新型的非熱殺菌技術(shù)被廣泛應(yīng)用，在食品加工中一般以液體為介質(zhì)，作用過程產(chǎn)生空化效應(yīng)，破壞菌體細胞結(jié)構(gòu)，使微生物細胞處于亞損傷狀態(tài)，但是單獨作用時低強度下殺菌效果不明顯，需要大幅度增加超聲強度來提高殺菌效果，易造成能源的浪費。因此，將超聲與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合作用會大幅度提高殺菌效果[6-7]。國內(nèi)外研究者對超聲協(xié)同化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生的強化殺菌效應(yīng)進行了研究，文獻[8]研究發(fā)現(xiàn)，超聲和臭氧共同作用對單增李斯特菌的殺菌效果比單一殺菌技術(shù)提升約30%；文獻[9]研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素和超聲協(xié)同作用會顯著提高對葡萄球菌的殺菌效果；文獻[10]研究發(fā)現(xiàn)，超聲會顯著提高戊二醛對孢子懸浮液的殺滅效果；文獻[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲結(jié)合牛至精油對生菜中大腸桿菌O157:H7的殺菌比單一牛至精油殺菌效果提高了26%。

微生物殺菌效果的動力學(xué)模型是研究殺菌技術(shù)的關(guān)鍵理論之一，對其實際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義[12-13]。目前，關(guān)于超聲協(xié)同化學(xué)殺菌劑的研究多數(shù)集中在證明二者之間的協(xié)同效應(yīng)，對其協(xié)同殺菌動力學(xué)過程缺乏詳細研究。本文以食品中常見的3株典型菌種為模型菌，研究超聲協(xié)同次氯酸鈉對模型菌的殺菌效果，采用一級動力學(xué)、Weibull、Logistic模型擬合殺菌動力學(xué)曲線，并對模型擬合度進行定量評價，利用生物電鏡觀察菌種微觀結(jié)構(gòu)破壞情況，并測定殺菌處理后3種指示菌細胞內(nèi)物質(zhì)的損失，以期為微生物殺菌提供重要的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指示菌：大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、考克氏菌(K.marina)，為實驗室保存菌種。

培養(yǎng)基及化學(xué)試劑：伊紅美藍培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；次氯酸鈉(NaClO)溶液，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。中和試劑：5 g/L的硫代硫酸鈉溶液，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。戊二醛固定液，北京華越洋生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；核酸蛋白分析儀，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司。S-3400 N(HITACHI)型掃描電鏡，日本Giko公司。

1.3 方法

1.3.1菌懸液的制備

將斜面保存的E.coli、B.subtilis、K.marina取出，并分別加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為0.85%的滅菌生理鹽水，將菌苔充分洗滌并吸取1 mL菌懸液到帶有玻璃珠的三角瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)為0.85%的無菌生理鹽水進行稀釋并振蕩30 min，將菌苔打碎，用核酸蛋白分析儀測定細胞濃度，調(diào)整菌懸液菌體濃度至107cfu/mL。

1.3.2懸液定量殺菌試驗

參照GB 15981—1995中懸液定量的方法評價化學(xué)消毒劑的殺滅效果，用滅菌蒸餾水將10 g/L的NaClO溶液稀釋成質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L，吸取4.5 mL的NaClO溶液于滅菌試管中，加入0.5 mL菌懸液，混勻，并超聲處理，設(shè)置超聲功率60、120、150 W，超聲時間60、90、120、150、180 s。殺菌處理后，同時取0.5 mL菌液加入到4.5 mL的中和試劑內(nèi)終止消毒劑繼續(xù)殺菌，中和10 min，采用平板計數(shù)法對不同殺菌條件下的殘留活菌數(shù)進行計數(shù)。利用殺菌處理前后樣品微生物殘存率對數(shù)值表示超聲協(xié)同NaClO致死效果(致死率C為負數(shù)，其絕對值越大表示致死效果越強)，空白組為不經(jīng)過超聲處理(即單獨次氯酸鈉殺菌處理)，試驗重復(fù)3次，致死率計算公式為

(1)

式中N0——超聲輔助次氯酸鈉殺菌前細菌菌落菌體濃度，cfu/mL

N——超聲輔助次氯酸鈉殺菌后細菌菌落菌體濃度，cfu/mL

1.3.3微生物殺菌動力學(xué)模型

微生物殺滅效果的動力學(xué)模型是研究殺菌技術(shù)的關(guān)鍵理論，對其實際應(yīng)用具有重要的理論指導(dǎo)意義。本研究選用一級動力學(xué)、Weibull、Logistic模型對超聲協(xié)同次氯酸鈉對3種典型菌株的殺菌動力學(xué)過程進行擬合并對3種模型進行比較分析。

(1)一級動力學(xué)模型

一級動力學(xué)模型的使用是假設(shè)微生物具有相同的抗逆性，隨時間的變化微生物下降的對數(shù)值呈現(xiàn)線性變化[14]，模型公式為

(2)

式中t——殺菌處理時間，s

Dp——指數(shù)遞減時間，即某處理條件下每殺死90%的活菌數(shù)所需時間，s

(2)Weibull模型

Weibull模型用于描述各種線性和凹凸型曲線的非線性模型[15-16]，該模型假設(shè)菌體對殺菌強度的抗性具有差別且符合Weibull模型分布，文獻[17]研究發(fā)現(xiàn)Weibull模型能夠較好地擬合微酸性電解水與苯扎氯銨聯(lián)合溫和熱處理對蠟樣芽孢桿菌的殺菌動力學(xué)過程，本研究在Hussain基礎(chǔ)上做了簡化處理，公式為

(3)

式中a——規(guī)模參數(shù)，表示一定條件下降低一個對數(shù)級細菌所需時間

b——形狀因子，當b<1時曲線向上凹；b>1時曲線向下凹；b=1時為一條直線

(3)Logistic 模型

Logistic模型假設(shè)菌體對殺菌強度的抗性具有差別，文獻[18]發(fā)現(xiàn)該模型能夠很好地擬合微波對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌動力學(xué)過程，本研究在文獻[18]基礎(chǔ)上做了簡化處理，公式為

(4)

式中p——最低的殘存細菌菌落菌體濃度對數(shù)值

q、m——曲線方程的參數(shù)

(4)模型評價

Af、Bf、R2和均方根誤差4個參數(shù)通常作為一種定量的方法來評價模型[19]，Af是精確因子，表示預(yù)測值與實測值偏離程度。Bf是偏差因子，Bf>1表示模型預(yù)測值比實測值高；Bf<1表示模型預(yù)測值比實測值低；當Bf越接近1，模型擬合度越高；均方根誤差和R2均表示模型的精確度、可靠度，當R2越接近于1，均方根誤差越小，模型擬合度越好。

1.3.4掃描電鏡觀察

將3株菌種的單菌落分別接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，取出。將含有菌株的液體培養(yǎng)基加到已滅菌的10 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入質(zhì)量濃度為200 mg/L的次氯酸鈉溶液5 mL，同時置于超聲體系，超聲強度150 W，時間120 s。加入等量中和劑終止殺菌，離心10 min，棄掉上清液，加入無菌生理鹽水進行洗脫2次，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管內(nèi)，得到滅菌處理過后的菌泥，加入戊二醛固定液于4℃條件下固定2 h。用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次10 min；然后采用50%、70%、90%、100%的乙醇進行逐級脫水各1次，每次10 min；采用1∶1的100%乙醇/叔丁醇進行置換10 min；臨界點干燥、噴金，電鏡下觀察、拍照，獲得電鏡結(jié)果圖，未經(jīng)殺菌處理的對照樣本作同樣處理。

1.3.5細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失的測定

參照文獻[20]的方法對殺菌前后3種菌株菌懸液中可溶性蛋白及還原糖含量進行測定，取經(jīng)過超聲處理、超聲聯(lián)合次氯酸鈉、單獨次氯酸鈉殺菌處理后的3種菌株的菌懸液，各吸取2 mL菌液至乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔1 h取出，在7 000 r/min下離心10 min，取上層清液采用直接滴定法測定殺菌前后菌懸液中的還原糖含量。采用牛血清蛋白濃度-吸光度標準曲線法測定可溶性蛋白含量，同樣取殺菌后的菌懸液樣品2 mL，在-20℃冰箱中冷凍12 h，加入0.01 mol/L Tris-HCl (pH值8.0)緩沖液，準確吸取0.1 mL各處理樣品于10 mL具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G 250染色劑，混合后放置2 min，并于波長595 nm處測定吸光度，從標準曲線查得相應(yīng)樣品的蛋白含量。

1.4 試驗數(shù)據(jù)處理及分析

應(yīng)用SPSS Statistics 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Origin軟件作圖，使用Curve Expert進行模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液的殺菌效果

次氯酸鈉具有強氧化性，屬于一種安全高效消毒液，被廣泛應(yīng)用于食品原料的清洗殺菌過程中。研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉溶于水后水解形成次氯酸，次氯酸能夠穿透菌體細胞壁并進一步破壞蛋白質(zhì)及酶系統(tǒng)，影響細胞生命活動從而殺死微生物[21]。本研究選用60、120、150 W超聲與50、100、200 mg/L的次氯酸鈉聯(lián)合作用，研究超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液對E.coli、K.marina、B.subtilis殺滅效果，殺菌動態(tài)曲線如圖1所示。

圖1 超聲協(xié)同次氯酸鈉對3種指示菌的殺菌效果Fig.1 Effect of different ultrasonic treatments assisted sodium hypochlorite on inactivation of indicator bacteria

由圖1可知，E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量隨NaClO質(zhì)量濃度的增加而不斷增加，且不同質(zhì)量濃度的NaClO對3種指示菌的致死量具有顯著差異(P<0.05)。當NaClO質(zhì)量濃度達200 mg/L，單獨殺菌180 s后，菌懸液中E.coli、K.marina、B.subtilis致死率為(-3.83±0.134)、(-3.79±0.122)、(-2.38±0.136)個對數(shù)值，由此可見E.coli對NaClO的抗性較低，K.marina次之，而B.subtilis對NaClO具有較強的抗性，文獻[22]也研究了NaClO對E.coli和B.cereus的殺菌效果，研究結(jié)果得出當NaClO質(zhì)量濃度為100 mg/L時對E.coli的損壞程度較大，而對B.cereus的殺菌較弱，與本研究結(jié)果相一致，這可能是由于具有芽孢結(jié)構(gòu)的菌株對NaClO消毒液具有較強的抗性，加之菌體外層具有一層生物膜，NaClO難以滲透進入菌體內(nèi)部，導(dǎo)致NaClO對芽孢桿菌的殺滅能力較弱[23-24]。同樣，文獻[25]研究了氯、二氧化氯和過氧乙酸對B.cereus孢子結(jié)構(gòu)的殺菌效果，發(fā)現(xiàn)該菌株對3種化學(xué)殺菌劑具較強的抗性，需要濕熱條件對其進行聯(lián)合殺菌，才能達到良好的殺菌效果。

在NaClO質(zhì)量濃度相同的情況下，不同功率的超聲協(xié)同NaClO殺菌，隨處理時間的增加，對E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量逐漸增大。當NaClO質(zhì)量濃度為200 mg/L，超聲150 W處理180 s時，對E.coli的致死率絕對值為(4.54±0.164)個對數(shù)值，對K.marina和B.subtilis的致死率絕對值分別為(4.28±0.123)、(3.97±0.134)個對數(shù)值，較相同NaClO濃度單獨處理相同時間相比致死量顯著提高，提高了13%～67%。此外，處理時間相同、NaClO質(zhì)量濃度相同的情況下，對3種菌的致死量隨超聲強度的增強而增加，且高強度的超聲對低強度的超聲的協(xié)同殺菌效果顯著增加(P<0.05)。當NaClO質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L，超聲功率60 W，處理時間60～180 s，對比未經(jīng)過超聲處理的殺菌量不存在顯著差異(P>0.05)；當超聲功率為150 W時，對比超聲功率60 W，相同時間對3種指示菌的致死效果顯著增加。相似地，文獻[26]研究了超聲波輔助二氧化氯對雞蛋表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的殺滅效果，研究得出59 kHz超聲協(xié)同50 mg/L二氧化氯，處理5 min，對3個菌種的殺菌量達4個對數(shù)值，與本研究得出相同的規(guī)律，即超聲波會顯著提高殺菌劑的殺菌效果，可能是協(xié)同作用時超聲波優(yōu)先作用于菌體生物被膜結(jié)構(gòu)，通過強烈的空化效應(yīng)破壞生物被膜三維結(jié)構(gòu)使內(nèi)部菌體暴露，導(dǎo)致細菌通透性增加，菌體蛋白質(zhì)及DNA滲漏，代謝酶活性降低，殺菌劑便可直接作用于裸露的菌體，強化殺菌效應(yīng)[27-29]。文獻[30]做了前期工作，采用160 W的超聲波和5～62℃的熱處理聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)比二者單獨使用具有更好的殺菌效果，且處理時間短，耗能少。文獻[31]研究同樣得出超聲在微生物殺菌過程中與其他滅菌技術(shù)聯(lián)合效果更好，如熱處理，氯化作用，加壓條件下等。

2.2 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液殺菌效果動力學(xué)分析

運用一級動力學(xué)、Weibull、Logistic模型對超聲協(xié)同NaClO對E.coli、K.marina、B.subtilis的滅活動力學(xué)曲線進行擬合，其擬合模型參數(shù)如表1～3所示。

表1 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對E.coli致死效果的動力學(xué)模型參數(shù)Tab.1 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on E. coli

表2 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對K.marina致死效果的動力學(xué)模型參數(shù)Tab.2 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on K. marina

表3 3種模型擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對B.subtilis致死效果的動力學(xué)模型參數(shù)Tab.3 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on B. subtilis

決定系數(shù)一般用來對模型擬合程度做一個總體評價[32]，由表1～3可知，采用一級動力學(xué)模型擬合獲得不同殺菌處理條件下的直線，其部分決定系數(shù)R2小于0.95，尤其當NaClO質(zhì)量濃度及超聲強度增大后線性擬合效果較差。而利用Weibull模型擬合的動力學(xué)曲線，其R2均大于0.95。Logistic模型對高強度的超聲體系協(xié)同NaClO的殺菌動力學(xué)曲線進行擬合，R2在0.90～0.95之間。一級動力學(xué)模型認為微生物殘留菌數(shù)量與時間呈現(xiàn)線性關(guān)系[33]，而本研究發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同NaClO殺菌更符合非線性模型，在超聲功率及NaClO質(zhì)量濃度較低的情況下的殺菌動力學(xué)過程中Weibull模型和Logistic模型均可以很好地擬合動力學(xué)曲線，隨超聲功率及NaClO質(zhì)量濃度的增加，Weibull模型更加符合殺菌過程。因此，超聲協(xié)同NaClO對3種典型菌株的殺菌過程更加符合Weibull模型。

2.3 模型擬合度評價

為了進一步比較Weibull模型和Logistic模型對超聲協(xié)同NaClO殺菌過程的擬合度，進一步比較分析了模型評價參數(shù)Af、Bf、均方根誤差和R2。由表4可知，Weibull模型的Af和均方根誤差均低于Logistic模型，說明Weibull模型預(yù)測的平均精確度較高，離散程度較低，同時Weibull模型的Bf和R2較Logistic模型更接近于1。因此，Weibull模型從整體上能夠很好地擬合超聲協(xié)同NaClO的殺菌動力學(xué)過程。

表4 數(shù)學(xué)模型評價參數(shù)的比較Tab.4 Comparison of evaluation indices of mathematics model

通過比較Weibull模型和Logistic模型回歸方程所得預(yù)測值和實測值的接近程度，以實測數(shù)據(jù)為橫坐標，模型預(yù)測數(shù)據(jù)為縱坐標作圖，利用線性擬合得到的相關(guān)性方程及決定系數(shù)R2來判斷預(yù)測值和實測值的差異。由圖2可知，Weibull模型和Logistic模型對超聲協(xié)同NaClO對3種典型菌株致死率的預(yù)測值與實測值之間具有較好的相關(guān)性。線性相關(guān)方程的斜率及截距越接近于0，R2越接近于1，表明模型擬合效果越好。Weibull模型對E.coli、K.matina、B.subtilis殺菌擬合得到的方程分別為y=1.002 52x+0.007 36、y=0.994 97x-0.021 13、y=0.990 0x-0.003 6，對應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.983 8、0.985 8、0.985 3；Logistic模型擬合得到的方程分別為y=0.996 99x+0.046 92、y=0.985 78x-0.007 16、y=1.003 1x+0.015 2，對應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.965 3、0.963 6、0.964 4。因此，Weibull模型較Logistic模型能夠較好地模擬超聲協(xié)同NaClO殺菌的動力學(xué)過程。

圖2 超聲協(xié)同次氯酸鈉溶液殺菌效果預(yù)測值和實測值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between observed and predicted values for inactivation effects of sodium hypochlorite combined with ultrasonic treatment

2.4 Weibull模型參數(shù)與超聲強度的關(guān)系分析

通過比較得出Weibull模型較線性模型和Logistic模型能夠很好地擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉的殺菌動力學(xué)過程。參數(shù)a可以反映殺菌的效果[34]，由圖3和表5分析得出，參數(shù)a與超聲強度具有很好的負相關(guān)，R2均不小于0.917。模型公式中形狀參數(shù)b與超聲強度呈現(xiàn)較好的負相關(guān)，R2均不小于0.852，b值隨超聲強度的增加逐漸減小，且較高強度的超聲協(xié)同作用下參數(shù)b均小于1，參數(shù)b反映的是曲線形狀，說明曲線拖尾明顯，在同一超聲強度作用下，延長殺菌時間并不一定能夠顯著提高殺菌效果，而且由相關(guān)研究同樣證明超聲強度增加到一定程度后，其空化效應(yīng)會減弱，殺菌率也會趨于平緩，與其他相關(guān)研究結(jié)果一致[35]。

表5 相關(guān)性方程Tab.5 Correlation equation

圖3 Weibull模型參數(shù)a和b與超聲強度的關(guān)系Fig.3 Correlation between Weibull model parameter a or b and ultrasonic intensity

2.5 超聲協(xié)同次氯酸鈉的殺菌機理分析

2.5.1掃描電鏡觀察結(jié)果

為了進一步探究超聲協(xié)同NaClO對3種典型菌株細胞菌體破壞情況，本研究利用生物掃描電鏡對超聲協(xié)同NaClO及單獨NaClO處理前后E.coli、K.matina、B.subtilis的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果如圖4所示。

由單獨NaClO溶液及超聲協(xié)同NaClO溶液殺菌處理前后3種指示菌掃描電鏡結(jié)果(圖4，放大倍數(shù)2 000～3 500)，可以看出3種菌株殺菌前后菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。未經(jīng)殺菌處理的E.coli(圖4a)呈現(xiàn)規(guī)則的長桿狀，菌體胞壁周圍完整，輪廓清晰，胞質(zhì)均勻；K.marina(圖4d)表現(xiàn)為球形，胞壁光滑完整，輪廓清晰，胞質(zhì)均勻；B.subtilis為規(guī)則的梭形，胞壁光滑完整，且細胞壁與細胞膜之間無間隙，胞質(zhì)均勻飽滿。

圖4 超聲協(xié)同次氯酸鈉對指示菌處理前后的掃描電鏡圖Fig.4 SEM photos of indicator bacteria before and after treatment with ultrasound combined with sodium hypochlorite

由圖4b、4e、4h可知，經(jīng)過NaClO單獨處理后3種指示菌菌體塌陷，原生質(zhì)溶出，其中E.coli菌體中部凹陷嚴重且存在部分細胞碎片，K.marina細胞壁裂解，細胞皺縮，B.subtilis表現(xiàn)嚴重的皺縮現(xiàn)象，細胞質(zhì)損失嚴重。而超聲協(xié)同NaClO處理后，3種指示菌菌體破壞大，其中E.coli形態(tài)變化最為嚴重(圖4c)，多數(shù)菌體已呈現(xiàn)碎片狀態(tài)，K.marina細胞壁破裂崩解，胞質(zhì)溶出，B.subtilis菌體表面起皺，胞質(zhì)溶出并向外滲出，細胞發(fā)生嚴重皺縮且殘存少部分細胞碎片。關(guān)于菌體殺菌機理目前多數(shù)研究學(xué)者認為細菌的死亡是通過破壞菌體細胞壁使菌株內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，引起菌體對外界環(huán)境的抗性降低，進而在殺菌條件下致使其死亡[36-38]。超聲協(xié)同NaClO會加速菌體裂解死亡，可能原因是在殺菌過程中超聲優(yōu)先作用于菌體細胞壁，破壞了菌體外層結(jié)構(gòu)，NaClO便直接作用于裸露的菌體，加速菌體細胞死亡。文獻[39]建立了超聲波產(chǎn)生的剪切力造成微生物表面附近塌陷的模型，進一步闡明了超聲波能夠破壞菌體外層結(jié)構(gòu)，此外，文獻[40]關(guān)于超聲波的殺菌機制進行了闡釋，認為超聲產(chǎn)生的空化效果，即微泡的形成、生長和潰滅導(dǎo)致機械效應(yīng)，進而破壞菌體結(jié)構(gòu)。

2.5.2細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失

為了進一步研究超聲協(xié)同NaClO對3種典型菌株菌體的破壞情況，測定并比較了超聲協(xié)同NaClO和單獨NaClO殺菌處理前后細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失情況，其中單獨NaClO溶液處理條件為200 mg/L、2 min，超聲協(xié)同NaClO處理條件為150 W、200 mg/L、180 s，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲協(xié)同次氯酸鈉殺菌對細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失的影響Fig.5 Effect of ultrasonic assisted sodium hypochlorite sterilization on loss of intracellular material of bacteria

由圖5可知，經(jīng)過殺菌處理的3種菌株菌懸液中還原糖及可溶性蛋白質(zhì)均出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，超聲聯(lián)合NaClO殺菌處理較單獨NaClO殺菌，菌懸液中還原糖及可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加，還原糖及可溶性蛋白質(zhì)含量均增長了近30%，尤其以E.coli菌懸液最為明顯，還原糖含量(質(zhì)量比)及可溶性蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量濃度)分別達到0.76 g/(100 g)、57.36 mg/mL。由此可見，超聲協(xié)同NaClO會極大地損傷菌體細胞膜，進而改變細胞膜通透性，使菌體中可溶性蛋白質(zhì)及還原糖滲出，加速了菌體死亡，與掃描電鏡結(jié)果相一致。

3 結(jié)束語

超聲協(xié)同NaClO對3種典型菌種的致死起到了一定的協(xié)同作用，且表現(xiàn)為高強度的超聲功率(60 W以上)能夠顯著提高NaClO的殺菌效果，在超聲功率150 W、NaClO質(zhì)量濃度200 mg/L、作用時間180 s的條件下對大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌的殺菌量分別為(4.54±0.164)、(4.28±0.123)、(3.97±0.134)個對數(shù)值，對比單獨NaClO的殺菌量提高了13%～67%。對其殺菌效果動力學(xué)過程進行分析得出，與一級動力學(xué)模型和Logistic模型相比，Weibull模型整體上能更好地擬合超聲協(xié)同次氯酸鈉對大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌的失活動力學(xué)過程。通過觀察超聲協(xié)同次氯酸鈉對3種典型菌株微觀結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同次氯酸鈉會破壞菌體細胞壁，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致細胞質(zhì)外溢，促使胞質(zhì)內(nèi)部還原糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì)滲出，部分細胞器溶解及細胞皺縮，最終致使細胞死亡。該研究可為超聲協(xié)同次氯酸鈉廣泛用于微生物殺菌提供方法依據(jù)。