牛肉肌纖維類型差異及成熟過程中組織蛋白酶活性研究

豐永紅 李海鵬 張松山 謝 鵬 徐晨晨 孫寶忠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 北京 100193)

0 引言

肌纖維是組成肌肉的基本單位，其類型、直徑、密度及完整性與肉的嫩度密切相關(guān)，肌束中肌纖維數(shù)越多，肌纖維越細(xì)，肉就越嫩[1]。通常按照形態(tài)或生理功能將肌纖維分為不同的類型。早期，肉類科學(xué)家依據(jù)肌肉顏色將骨骼肌分為紅肌和白肌兩種類型[2]，肌肉色澤與肉品質(zhì)及動(dòng)物生長(zhǎng)性能有關(guān)，高比例的紅肌纖維在一定程度上代表較好的肉品質(zhì)，而高比例的白肌纖維則更多地代表較強(qiáng)的生長(zhǎng)性能[3]。隨著對(duì)肌纖維研究的深入，依據(jù)其收縮和代謝特點(diǎn)進(jìn)一步將肌纖維分為慢收縮氧化型(Slow oxidative，SO)、快收縮氧化型(Fast oxidative，F(xiàn)O)、快收縮氧化酵解型(Fast oxido-glycolytic，F(xiàn)OG)及快收縮酵解型(Fastglycolytic，F(xiàn)G)[4]。目前較為廣泛應(yīng)用的ATP酶染色法將肌纖維分為Ⅰ、ⅡA、ⅡB，也是基于肌纖維收縮特點(diǎn)的分型。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，根據(jù)肌纖維所含肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MyHC) 的不同亞型，將肌纖維分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx 和Ⅱb ，代謝類型從氧化到酵解過渡，收縮速度依次增加[5]。因此，可以將MyHC基因作為分子標(biāo)記，利用RT-PCR分析方法研究肌纖維類型及組成，相比于其他組化染色法該方法既省時(shí)又省力[6]。

依據(jù)不同肌纖維類型的代謝特性以及MyHC基因亞型的不同，肌纖維的分型方法主要有：組織化學(xué)法(ATPase法)、免疫印跡法、免疫組化法、RT-PCR法、單向凝膠電泳后LC-MS/MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)法[7-8]。盡管LC-MS/MS法所得總肽數(shù)與免疫組化法所得結(jié)果呈極高度正相關(guān)，但由于受個(gè)別蛋白質(zhì)和肽的限制，該法仍不能用于MyHC的定量研究[7-8]。盡管肌纖維因分類方法多樣而命名各異，但不同分類方法確定的肌纖維之間存在一定的相關(guān)性，如SO型肌纖維即為Ⅰ型，F(xiàn)O型肌纖維為Ⅱa型，F(xiàn)G型肌纖維為Ⅱb型，F(xiàn)OG型肌纖維為Ⅱx型[9]。然而，不同分類方法所確定的肌纖維類型之間是否存在完全對(duì)應(yīng)關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究[10]。

近年來研究表明，肌肉中不同肌纖維類型的比例可影響宰后肉的嫩度[11]，較高的Ⅰ型肌纖維和較低的ⅡB型肌纖維比例有利于降低肉的剪切力、提高肉的嫩度[12]。一般認(rèn)為，宰后成熟過程是肌肉內(nèi)源蛋白質(zhì)水解酶的作用所致，肉的嫩化是一個(gè)復(fù)雜的物理化學(xué)(包括pH值和離子強(qiáng)度)和生物化學(xué)(細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶)過程，在這個(gè)過程中，肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞骨架逐漸消失[13]。組織蛋白酶存在于溶酶體中，溶酶體膜在成熟過程中會(huì)遭到破壞，使組織蛋白酶從中釋放出來，與肌原纖維蛋白接觸[14-16]。因此，很多學(xué)者認(rèn)為，在宰后成熟過程中，鈣激活酶對(duì)肌肉骨架蛋白進(jìn)行初步降解，組織蛋白酶在成熟后期對(duì)骨架蛋白進(jìn)行進(jìn)一步降解[17-19]。更深入的研究表明，在宰后成熟過程中溶酶體膜穩(wěn)定性降低，組織蛋白酶從中釋放出來后被活化，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)的發(fā)生[20]。位于細(xì)胞溶酶體中的組織蛋白酶大約有16種，依據(jù)活性位置可分為4類：天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、金屬蛋白酶，與肌肉成熟有關(guān)的主要是組織蛋白酶B (EC 3.4.22.1)、L (EC 3.4.22.15)、H (EC 3.4.22.16)和D (EC 3.4.23.5)。B、H、L屬半胱氨酸類組織蛋白酶，在活體內(nèi)由半胱氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)[21]。關(guān)于組織蛋白酶的提取和活性檢測(cè)已有大量研究，但肌纖維類型組成與組織蛋白酶之間的關(guān)系尚未見報(bào)道，本文通過考察不同肌纖維類型組成的各部位牛肉在宰后成熟過程中組織蛋白酶B、H、L活性的變化，研究肌纖維類型與組織蛋白酶之間的關(guān)系，進(jìn)而探討不同類型的肌纖維通過其組織蛋白酶活性差異影響牛肉宰后成熟過程中嫩度變化的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛肉樣品取自新疆伊寧縣伊新牛羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社。選取6頭30月齡新疆褐牛公牛，按照GB/T 19477—2004《牛屠宰操作規(guī)程》[22]屠宰后熱剔骨分割取左半胴體的岡下肌、菱形肌、腰大肌、背最長(zhǎng)肌、背闊肌、腓腸肌、半腱肌和股二頭肌共8個(gè)部位肉，按以下操作取樣：切2 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的肉樣各3條迅速置于液氮中冷凍以固定形狀，然后用鋁箔包裝投入液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱(用于ATPase染色)；取約100 mg肉樣3塊，置于液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱(用于RT-PCR分型)；取約10 g肉樣鋁箔包好后液氮冷凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于組織蛋白酶活性檢測(cè)。另取約100 g肉樣真空包裝后置于4℃冰箱中成熟，分別在宰后的3、7、9、11、14 d取樣，取樣時(shí)切取10 g左右樣品鋁箔包好后先用液氮迅速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱內(nèi)，用于檢測(cè)組織蛋白酶活性。所有樣品按照保存要求置于干冰或冰塊中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑：7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC)、Z-精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽、Z-苯丙氨酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽、L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽，均購(gòu)自Sigma公司。RNAPrep Pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒D431、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)KR106、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版FP205，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

FJ200-S型高速均質(zhì)機(jī)(北京維欣儀奧科技有限公司)；LG10-24A型高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；leica CM1860型冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；leica DM6000 B型正置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；HH-4 型可調(diào)恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；Tecan Infinite 200 Pro型多功能酶標(biāo)儀(Tecan 集團(tuán)有限公司)；LineGene 9600型熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)；OSE-Y30型高速組織研磨器、OSE-DB-01加熱型金屬浴、OSE-MC8微型離心機(jī)(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1肌纖維類型、直徑、面積測(cè)定

肌纖維類型分型采用ATP酶組織化學(xué)染色法中的堿性染色法[23-24]：采用萊卡冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，制備8 μm厚的新鮮切片，室溫(20℃)晾干后，加入堿性ATP孵育液(ATP酶工作液(0.01 mol/L甘氨酸-氯化鈉溶液50 mL，1 mol/L氯化鈣溶液10 mL，0.1 mol/L氫氧化鈉溶液35 mL，pH值為9.5～9.6)10 mL加入三磷酸腺苷二鈉0.3 g溶解，pH值9.45)，37℃培育2 h。除去ATP酶工作液，置于1%氯化鈣溶液6 min；除去氯化鈣溶液，置于2%氯化鈷溶液，蒸餾水洗3次，每次5 min；硫化銨溶液(10 mL蒸餾水加入8滴硫化銨)顯色約1 min；自來水洗3次，乙醇脫水二甲苯透明后用樹膠封片，生物顯微鏡100、400倍下鏡檢并拍照。本試驗(yàn)中，ⅡB型纖維被染成深褐色，ⅡA型纖維被染成淺褐色，Ⅰ型纖維顏色最淺。

1.3.2MyHC基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

引物設(shè)計(jì)：在NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)官網(wǎng)上查詢基因序列，并采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，具體見表1。

表1 RT-PCR分析用MyHC引物序列Tab.1 Primers used for real-time PCR analysis of MyHC gene expression

提取樣本總RNA：使用天根生化科技(北京)有限公司的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(DP431)提取樣本的RNA，試驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，略有改動(dòng)。提取的RNA濃度用酶標(biāo)儀檢測(cè)，后凍存于-80℃。

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：使用天根生化科技(北京)有限公司的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR106)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，試驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，略有改動(dòng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版FP205進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，略有改動(dòng)。擴(kuò)增程序：95℃、15 min，(95℃、10 s，60℃、32 s)×40個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄體系：10 μL 2×SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版；0.5 μL上游引物(10 μmol/L)；0.5 μL下游引物(10 μmol/L)；2 μL cDNA模板；加入去RNA酶的雙蒸水至20 μL。

引物篩選：將各樣本cDNA混合后進(jìn)行5倍梯度稀釋。稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析。

樣品RT-PCR檢測(cè)：將各樣品cDNA 稀釋10倍后取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。同時(shí)在60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析。

根據(jù)RT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為

F=2-[A-B-(C-D)]

式中A——待測(cè)組目的基因平均Ct值

B——待測(cè)組管家基因平均Ct值

C——對(duì)照組目的基因平均Ct值

D——對(duì)照組管家基因平均Ct值

1.3.3組織蛋白酶活性測(cè)定

組織蛋白酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[25]的方法并加以改動(dòng)。首先提取肌漿蛋白，提取方法：稱取2 g絞碎的肉樣，加入10 mL緩沖液A(50 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH值7.5)、10 mmol/L的β-巰基乙醇、1 mmol/L EDTA)，用高速分散機(jī)均質(zhì)兩次，每次30 s。置于冷凍離心機(jī)在4℃、10 000g下離心20 min，收集上清液，用玻璃棉過濾，濾液作為組織蛋白酶的粗提取物。

組織蛋白酶 L、B、H 活力的測(cè)定：反應(yīng)在218 μL的混合液中進(jìn)行，反應(yīng)混合液包括98 μL 0.1% Brij35(月桂醇聚氧乙烯醚)、40 μL 0.4 mol/L含5 mmol/L EDTA的緩沖液(L+B、B及H緩沖體系的pH值分別為5.5、6.0、6.8)、20 μL 10 mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)和20 μL酶的粗提取液。將反應(yīng)混合液置于40℃水浴中2 min后分別加入底物(Z-苯丙氨酰-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素鹽酸鹽(B+L)、Z-精氨酸-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素鹽酸鹽(B)和L-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素鹽酸鹽(H))40 μL，繼續(xù)在40℃水浴中反應(yīng)30 min后加入300 μL終止液(0.1 mol/L乙酸鈉和0.1 mol/L氯乙酸鈉，pH值4.3)終止反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)催化1 μmol AMC 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

以Image J圖像分析軟件分析Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維數(shù)量百分比。計(jì)數(shù)時(shí)每個(gè)切片至少取5個(gè)區(qū)域，每個(gè)樣品需500個(gè)以上肌纖維。用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分析Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維的面積和直徑，每個(gè)切片至少取5個(gè)區(qū)域。

采用SPSS 20.0及Microsoft Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行Duncan’s分析，采用SPSS皮爾遜(Pearson)法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各部位牛肉肌纖維類型組成

2.1.1ATP酶法分析各部位牛肉肌纖維類型組成典型的ATP酶組織化學(xué)法堿染色(pH值9.45)照片見圖1，除腰大肌放大倍數(shù)為10×40倍外，其他均為10×10倍，圖中標(biāo)尺為25 μm。圖中ⅡB型肌纖維、ⅡA型肌纖維、Ⅰ型肌纖維的顏色由深到淺。從圖中可以看出，各部位肉的肌纖維類型組成差別較大，大部分部位牛肌肉由3種肌纖維類型組成，但組成比例及面積和直徑有差異；而岡下肌沒有ⅡA型肌纖維，菱形肌幾乎沒有ⅡB型肌纖維，腰大肌的肌纖維面積和直徑明顯小于其他部位肉的肌纖維面積和直徑，且從照片看腰大肌的肌纖維之間間隙較大，說明其結(jié)構(gòu)較松散。通常認(rèn)為肌纖維總數(shù)在動(dòng)物出生后基本保持不變，但肌纖維類型在生長(zhǎng)過程中持續(xù)相互轉(zhuǎn)化，且其轉(zhuǎn)化是環(huán)境等外界因素和機(jī)體內(nèi)部因子協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。動(dòng)物出生時(shí)主要以氧化型肌纖維為主，一些肌纖維在生長(zhǎng)過程中具有由氧化型向酵解型轉(zhuǎn)化的能力，一些后天因素會(huì)導(dǎo)致肌纖維類型整體由氧化型向酵解型轉(zhuǎn)化，且早期生長(zhǎng)階段是肌纖維類型轉(zhuǎn)變的重要階段[26]?？傮w來說，在動(dòng)物的成長(zhǎng)過程中，肌纖維遵循以下路徑發(fā)生類型的轉(zhuǎn)化：Ⅰ?ⅡA?ⅡX?ⅡB[27-28]。而低甲狀腺激素水平和長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練可能會(huì)導(dǎo)致肌纖維類型由快肌向慢肌轉(zhuǎn)化，即按照ⅡB?ⅡX?ⅡA?Ⅰ的方向轉(zhuǎn)化[29-30]。本研究的結(jié)果也表明，新疆褐牛的不同部位肉肌纖維類型組成存在較大的差異，這與學(xué)者對(duì)其他動(dòng)物的研究結(jié)果相一致[23,31-32]。

圖1 各部位肉ATP酶染色照片F(xiàn)ig.1 Pictures of various beef cuts stained for ATPase reactivity

對(duì)新疆褐牛不同部位肉的各肌纖維類型數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。可以看出不同部位肌肉間肌纖維類型的組成顯著不同(p<0.05)，最為典型的是岡下肌和菱形肌，岡下肌由Ⅰ型肌纖維和ⅡB型肌纖維組成，且數(shù)量比與其他部位肉差異顯著(p<0.05)；菱形肌基本上由ⅡA型肌纖維和Ⅰ型肌纖維組成，ⅡB型肌纖維僅占到2.12%，ⅡB和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比均與其他部位肉差異顯著(p<0.05)。從各部位肉的主要肌纖維類型來分析，半腱肌和背最長(zhǎng)肌均以ⅡB型肌纖維為主要類型，分別占47.87%和40.85%，而岡下肌、腰大肌、背闊肌和股二頭肌以Ⅰ型肌纖維為主，分別占到79.69%、43.06%、42.63%和39.75%，菱形肌和腓腸肌則以ⅡA型肌纖維為主，分別占到61.43%和42.10%。其中半腱肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌的肌纖維類型組成與郎玉苗[33]對(duì)西門塔爾牛這3個(gè)部位肌肉的研究基本一致。

圖2 各部位牛肉肌纖維類型數(shù)量比Fig.2 Proportion of different muscle fiber types in various beef cuts

2.1.2各部位牛肉肌纖維面積和直徑

由圖3(圖中不同字母表示同一肌纖維類型不同部位間差異顯著，p<0.05，下同)可以看出，在各部位肉中，大部分以ⅡB型肌纖維面積最大，Ⅰ型肌纖維面積最小，ⅡA型肌纖維面積居中。8個(gè)部位相比較，菱形肌的ⅡA型肌纖維面積顯著大于其他部位；菱形肌的Ⅰ型肌纖維面積最大，但與背最長(zhǎng)肌和股二頭肌沒有顯著差異；ⅡB型肌纖維面積最大的是背最長(zhǎng)肌，但與半腱肌、背闊肌和股二頭肌的ⅡB型肌纖維面積差異不顯著；岡下肌的ⅡB型肌纖維面積顯著小于其他部位；腰大肌的ⅡA型肌纖維顯著小于其他部位；腰大肌的Ⅰ型肌纖維面積最小，但與腓腸肌和岡下肌的Ⅰ型肌纖維面積差異不顯著。其中，股二頭肌、菱形肌的肌纖維面積標(biāo)準(zhǔn)差較小，說明不同個(gè)體間的股二頭肌肌纖維面積差異和不同個(gè)體間的菱形肌肌纖維面積差異均較小，而腰大肌、背最長(zhǎng)肌的肌纖維面積標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明不同個(gè)體間的腰大肌肌纖維面積差異和不同個(gè)體間的背最長(zhǎng)肌肌纖維面積差異均較大。

圖3 各部位牛肉肌纖維面積Fig.3 Cross-sectional area of different muscle fiber types in various beef cuts

結(jié)合各肌纖維類型單個(gè)肌纖維的面積和數(shù)量比，計(jì)算各部位肉不同肌纖維類型占整個(gè)部位肉橫截面的面積百分比，結(jié)果見圖4。岡下肌的Ⅰ型肌纖維占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，菱形肌依然是ⅡA型肌纖維占據(jù)優(yōu)勢(shì)。半腱肌、腰大肌、背最長(zhǎng)肌、背闊肌的ⅡB型肌纖維占到一半左右。而股二頭肌的3種肌纖維類型面積百分比基本均分。腓腸肌的ⅡA型和ⅡB型面積百分比相當(dāng)(約36%)，略大于Ⅰ型面積比。

圖4 各部位牛肉不同肌纖維類型的面積百分比Fig.4 Area proportion of different muscle fiber typesin various beef cuts

各部位肉肌纖維直徑見圖5，與肌纖維面積的規(guī)律相類似。肌纖維直徑最大的為菱形肌，其次為股二頭肌、背最長(zhǎng)肌、背闊肌、半腱肌，然后為腓腸肌、岡下肌、腰大肌。腰大肌的標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明不同個(gè)體牛之間的腰大肌直徑差異較大。

圖5 各部位牛肉肌纖維直徑Fig.5 Diameter of different muscle fiber types in various beef cuts

2.1.3MyHC基因表達(dá)量

圖6表明，岡下肌的Ⅰ型MyHC基因表達(dá)量顯著高于其他部位，而菱形肌的Ⅱa型MyHC基因表達(dá)量顯著高于其他部位，Ⅱx型MyHC基因在半腱肌、腓腸肌和腰大肌中有比較突出的表達(dá)。Ⅱb型MyHC基因在8個(gè)部位肉中均沒有表達(dá)，這與早期對(duì)牛骨骼肌的研究結(jié)果相一致[34-35]。

圖6 各部位牛肉MyHC基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 MyHC expression in various beef cuts

文獻(xiàn)[36]對(duì)18～24月齡公牛的背最長(zhǎng)肌、咬肌、膈、眼外肌等10個(gè)部位進(jìn)行研究，僅在眼外肌中發(fā)現(xiàn)了MyHCⅡb型基因的表達(dá)，而PICARD等[7]對(duì)22頭公牛的半腱肌和背最長(zhǎng)肌進(jìn)行研究，僅在5頭中發(fā)現(xiàn)MyHCⅡb型基因的表達(dá)。國(guó)內(nèi)研究者對(duì)西雜牛背最長(zhǎng)肌、半腱肌和比目魚肌的研究[37]以及文獻(xiàn)[8]利用LC-MS/MS和免疫組化兩種方法對(duì)牛背最長(zhǎng)肌的研究均沒有發(fā)現(xiàn)MyHCⅡb型基因的表達(dá)。文獻(xiàn)[38]在馬的臀中肌中也未發(fā)現(xiàn)MyHCⅡb亞型的表達(dá)。因此研究者曾假設(shè)Ⅱb型作為MyHC的最快同型僅在小型哺乳動(dòng)物中表達(dá)的原因是其相對(duì)于大型哺乳動(dòng)物具有較快的肌肉收縮[30]，而牛和馬科動(dòng)物更適于慢氧化條件[39]。對(duì)比本研究與其他文獻(xiàn)的結(jié)果進(jìn)一步說明，不同品種不同年齡不同部位牛肉的肌球蛋白重鏈亞型表達(dá)存在差異。

圖7為各部位肉中不同類型MyHC基因表達(dá)所占的百分比，其中菱形肌、岡下肌和背闊肌3個(gè)部位的Ⅱx型只有少量表達(dá)，而菱形肌的Ⅱa型占到84.20%，岡下肌和背闊肌的Ⅰ型和Ⅱa型基本呈均分模式。腰大肌和半腱肌的MyHC基因表達(dá)以Ⅱx為主，分別占到60.95%和63.07%；腓腸肌的整體表達(dá)模式與腰大肌和半腱肌類似，Ⅱ型MyHC基因占到90%。背最長(zhǎng)肌和股二頭肌的3種基因表達(dá)百分比分配類似，Ⅱx和Ⅱa占到30%～40%，Ⅰ型所占百分比低于30%。所取8個(gè)部位肉在牛胴體的位置從前軀到后軀分別按照以下順序排列：前軀的菱形肌和岡下?。恢熊|的背闊肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌；后軀的股二頭肌、半腱肌和腓腸肌?？梢酝茰y(cè)在新疆褐牛中，MyHC基因表達(dá)模式可能與部位肉所處的軀體位置存在極大相關(guān)性，如作為前軀的菱形肌和岡下肌，以Ⅰ型和Ⅱa型為主，Ⅱx型的表達(dá)比例極少；后軀的股二頭肌、半腱肌和腓腸肌，Ⅰ型的表達(dá)比很少，以Ⅱ型為主。這可能與前中后軀不同部位肌肉的生理功能不同相關(guān)，MyHC基因表達(dá)模式與部位肉所處軀體位置的具體關(guān)系有待更深入的研究。

圖7 各部位牛肉MyHC基因相對(duì)表達(dá)百分比Fig.7 Percentage of MyHC expression in various beef cuts

2.2 兩種方法肌纖維類型的相關(guān)性

對(duì)新疆褐牛各部位肉肌纖維類型組成和MyHC基因型的相對(duì)表達(dá)量做相關(guān)性分析，結(jié)果列于表2。MyHCⅠ型基因的表達(dá)量與Ⅰ型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。MyHCⅡa型基因的表達(dá)量與ⅡB型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與ⅡA型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比均呈正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性不顯著。

表2 兩種分型方法肌纖維類型的相關(guān)性Tab.2 Relativity between muscle fiber types and MyHC expression

Ⅰ型MyHC基因的表達(dá)百分比與Ⅰ型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Ⅱa 型MyHC基因的表達(dá)百分比與ⅡB型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與ⅡA型肌纖維的面積百分比均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Ⅱx 型MyHC基因的表達(dá)百分比與ⅡB型肌纖維的數(shù)量百分比和面積百分比均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。這說明Ⅰ型MyHC基因與Ⅰ型肌纖維存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，而RT-PCR法確定的Ⅱx 型MyHC基因極有可能與ATPase法確定的ⅡB型肌纖維相對(duì)應(yīng)。

綜上結(jié)果表明，在新疆褐牛中MyHC基因型表達(dá)與ATPase法確定的肌纖維類型之間存在一定的相關(guān)性，在確定MyHCⅠ型基因與Ⅰ型肌纖維時(shí)兩種方法所得結(jié)果一致，而在確定Ⅱ型肌纖維和MyHCⅡ型基因時(shí)兩種方法所得結(jié)果并不完全一致。

2.3 組織蛋白酶B、L、H活性的變化

圖8～10分別為新疆褐牛各部位肉宰后成熟過程中組織蛋白酶B、H、L活性的變化。從圖中可以看出，3種組織蛋白酶活性基本遵循隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)先增大，然后又降低的規(guī)律。這是因?yàn)榻M織蛋白酶存在于溶酶體中，在活體組織中并不呈現(xiàn)活性，機(jī)體死亡后，溶酶體遭到破壞，組織蛋白酶逐漸釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中，表現(xiàn)為活性的逐漸升高，而在接觸到底物進(jìn)而發(fā)揮作用后活性又呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。文獻(xiàn)[40]對(duì)青海牦牛宰后成熟8 d內(nèi)的組織蛋白酶活性變化研究結(jié)果表明，組織蛋白酶B、H、L活性在8 d內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，與本文對(duì)新疆褐牛的研究結(jié)果基本一致。

圖8 牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶B活性的變化Fig.8 Change of cathepsin B’s activity during postmortem

不同部位肉的組織蛋白酶活性存在差異，宰后不同成熟時(shí)間的變化也有所不同，但變化規(guī)律基本一致。岡下肌的組織蛋白酶B活性最高，且與其他部位肉的活性存在顯著差異，其活性在第9天時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸降低；絕大部分部位肉的組織蛋白酶B活性在宰后成熟第9天或第11天時(shí)達(dá)到最大值，除背最長(zhǎng)肌外，其他部位肉在第9天和第11天時(shí)無顯著差異。而背闊肌的組織蛋白酶B活性在第3天時(shí)即達(dá)到最大值，從第7天到第11天無顯著性變化，第14天時(shí)又上升到第3天的活性水平。腰大肌的組織蛋白酶B活性處于持續(xù)上升趨勢(shì)，在第14天時(shí)達(dá)到最大值。這說明不同部位肉溶酶體膜破裂、組織蛋白酶釋放出來的速度不同，而14 d后組織蛋白酶的變化情況還有待進(jìn)一步研究。

新疆褐牛各部位肉的組織蛋白酶H活性較低，說明組織蛋白酶H在牛肉宰后成熟過程中所起的作用可能很小，可以忽略不計(jì)[21]。

圖9 牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶H活性的變化Fig.9 Change of cathepsin H’s activity during postmortem aging of beefaging of beef

宰后成熟過程中組織蛋白酶L活性變化規(guī)律與B相似，除腰大肌外其他各部位肉在第9天或第11天時(shí)達(dá)到最大值，而腰大肌的組織蛋白酶L活性則呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在第14天時(shí)達(dá)到最大。岡下肌的組織蛋白酶L活性也顯著高于其他部位肉。新疆褐牛肉中，組織蛋白酶L活性明顯高于B和H，以各部位的活性最大值計(jì)算，組織蛋白酶L活性是B的2.5～4倍，是H的10倍多甚至20倍，文獻(xiàn)[25]對(duì)牦牛肉的研究表明組織蛋白酶 L降解肌球蛋白的能力是組織蛋白酶B的10倍，在牛肉的宰后成熟過程中發(fā)揮著重要作用。這可能是由于組織蛋白酶B和H會(huì)因水洗處理受到損失，而L相對(duì)穩(wěn)定，不易損失，所以組織蛋白酶L在降解肌球蛋白重鏈方面起更大的作用[41]，它能快速降解肌鈣蛋白T和I，也能緩慢分解肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、重酶解肌球蛋白和輕酶解肌球蛋白[42]。同時(shí)牛肉成熟3 d以后肌肉的pH值基本保持在5.5～5.7，與組織蛋白酶L的最適pH值接近，從而使其能夠達(dá)到最大活力[43]。

圖10 牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶L活性的變化Fig.10 Change of cathepsin L’s activity during postmortem aging of beef

2.4 肌纖維類型數(shù)量比和面積比與組織蛋白酶活性的相關(guān)性分析

肌纖維類型的數(shù)量比和面積比分別與組織蛋白酶活性及活性變化率做相關(guān)性分析，結(jié)果如表3～5所示。組織蛋白酶活性變化率以活性最大值與初始值相比較來計(jì)算。

表3 各類型肌纖維與組織蛋白酶B活性相關(guān)性Tab.3 Relativity between different muscle fiber types and cathepsin B’s activity

表4 各類型肌纖維與組織蛋白酶L活性相關(guān)性Tab.4 Relativity between different muscle fiber types and cathepsin L’s activity

由表3可以看出，ⅡB型肌纖維與組織蛋白酶B活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而ⅡB型肌纖維面積比與宰后9、11 d組織蛋白酶B活性以及組織蛋白酶B活性的變化率極顯著或顯著負(fù)相關(guān)。ⅡA型肌纖維數(shù)量比與組織蛋白酶B活性變化率呈顯著負(fù)相關(guān)。ⅡA型肌纖維的面積比與宰后9 d時(shí)組織蛋白酶B活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Ⅰ型肌纖維數(shù)量比與組織蛋白酶B活性呈顯著甚至極顯著正相關(guān)關(guān)系，Ⅰ型肌纖維面積比也與宰后7～11 d組織蛋白酶B活性呈顯著甚至極顯著正相關(guān)關(guān)系。這說明，在新疆褐牛各部位肉中含有的Ⅰ型肌纖維越多、ⅡB型肌纖維越少，組織蛋白酶B活性就越高，越有助于宰后成熟過程中肉的嫩化。

肌纖維類型和組織蛋白酶L活性的相關(guān)性與肌纖維類型和組織蛋白酶B活性的相關(guān)性相類似，即ⅡB型肌纖維面積比與組織蛋白酶L活性呈負(fù)相關(guān)，而Ⅰ型肌纖維與宰后9、11 d組織蛋白酶L活性呈顯著甚至極顯著正相關(guān)。由于組織蛋白酶L活性是B活性的2.5～4倍，更有助于解釋肌纖維類型與宰后成熟的關(guān)系。由此可推斷在Ⅰ型肌纖維含量較高的牛肉中，由組織蛋白酶L參與降解的骨架蛋白在宰后成熟9 d以后的降解速度比ⅡB型肌纖維含量高的牛肉快。這一推斷需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

由于組織蛋白酶H活性非常低，在進(jìn)行與肌纖維類型的相關(guān)性分析時(shí)，除了與ⅡB型肌纖維數(shù)量比在宰后7 d時(shí)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系外，與其他指標(biāo)沒有顯著相關(guān)性，不具有參考價(jià)值。

3 結(jié)論

(1)新疆褐牛不同部位肉的肌纖維類型組成存在較大差異，最為典型的是岡下肌和菱形肌，岡下肌沒有ⅡA型肌纖維，菱形肌則幾乎沒有ⅡB型肌纖維。對(duì)大部分部位的牛肉來說，ⅡB型肌纖維的橫截面積和直徑最大，Ⅰ型肌纖維的橫截面積和直徑最小。不同個(gè)體的腰大肌肌纖維橫截面積和直徑相差較大，說明相對(duì)于其他部位牛肉而言，在牛的生長(zhǎng)過程中，腰大肌的肌纖維更易于受各種因素的影響。

(2)在新疆褐牛8個(gè)部位肉中，均未發(fā)現(xiàn)MyHCⅡb型基因的表達(dá)。MyHC基因的表達(dá)與各部位肉所處軀體的位置關(guān)系密切。兩種分型方法在確定Ⅰ型肌纖維時(shí)所得結(jié)果一致，而ATPase法確定的ⅡB型肌纖維可能與 RT-PCR法確定的MyHCⅡx型相對(duì)應(yīng)。

(3)組織蛋白酶L活性高，在宰后成熟中起重要作用。組織蛋白酶H活性非常低，在牛肉宰后成熟中的作用可以忽略。在宰后成熟過程中，3種組織蛋白酶活性基本呈現(xiàn)先增大、后減小的趨勢(shì)，在宰后9～11 d時(shí)達(dá)到最大值。腰大肌的組織蛋白酶活性呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在宰后14 d后的變化仍需進(jìn)一步研究。

(4)肌纖維類型與組織蛋白酶活性的相關(guān)性表明，各部位牛肉中Ⅰ型肌纖維比例越高，ⅡB型肌纖維比例越低，組織蛋白酶活性就越高，越有益于牛肉宰后成熟嫩化。