余甘子多酚微波-熱水浸提工藝的優(yōu)化及其pH穩(wěn)定性

李潔 王沂雯 鄭涵予 鐘焱 劉興艷 陳安均

摘要：以余甘子鮮果為原料，采用微波-熱水浸提法提取余甘子多酚，通過單因素與正交試驗優(yōu)化最佳提取工藝，同時探究pH對提取液中多酚穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，余甘子多酚的最佳提取工藝為：微波功率640 W處理3 min，料液比1∶20（質(zhì)量體積比），浸提溫度50 ℃，浸提時間6 min，與傳統(tǒng)的熱水浸提相比，總酚提取量、黃酮提取量、DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力分別提高了50.26%、21.41%、38.36%、18.38%。相關(guān)性分析結(jié)果表明，余甘子提取液中總酚、黃酮含量與DPPH自由基清除能力、FRAP鐵還原能力之間有顯著相關(guān)性（P<0.05）。pH穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，隨著pH的增加，余甘子提取液中總酚含量、FRAP鐵還原能力和DPPH自由基清除能力均先升高后降低，而黃酮含量在不同pH下差異不顯著（P>0.05）。HPLC分析結(jié)果表明，不同酚類物質(zhì)在不同的pH條件下穩(wěn)定性不同，大多在酸性或弱酸性條件下較穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：余甘子;多酚;微波-熱水浸提;正交優(yōu)化;pH穩(wěn)定性

中圖分類號：TS255.36文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0733-10

Optimization of microwave-hot water extraction process of polyphenols from Phyllanthus emblica L. and its pH stability

LI Jie，WANG Yi-wen，ZHENG Han-yu，ZHONG Yan，LIU Xing-yan，CHEN An-jun

（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Yaan 625000， China）

Abstract：The polyphenols were extracted from fresh Phyllanthus emblica L. by microwave-hot water extraction method. The optimal extraction process was optimized by single-factor and orthogonal experiments， and the effects of pH on the stability of polyphenols in the extraction solution were investigated. The results showed that the optimal extraction conditions of polyphenols were as follows： microwave power 640 W treatment for three minutes， solid-liquid ratio 1∶20， extraction temperature 50 ℃， extraction time six minutes. Compared with those under the traditional hot water extraction conditions， extraction amount of total phenol， extraction amount of flavonoids， DPPH free radical scavenging capacity and FRAP iron reducing capacity under the optional extraction conditions were increased by 50.26%， 21.41%， 38.36% and 18.38%， respectively. The results of correlation analysis showed that the contents of total phenols and flavonoids in the extraction solution were significantly correlated with DPPH free radical scavenging capacity and FRAP iron reducing capacity （P<0.05）. The results of pH stability indicated that with the increase of pH， the total phenol content， FRAP iron reducing capacity and DPPH free radical scavenging capacity increased first and then decreased， while the flavonoids contents showed no significant difference at different pH values （P>0.05）. HPLC analysis results showed that different phenols had different stability to pH， and most of them were stable under acidic or weakly acidic conditions.

Key words：Phyllanthus emblica L.;polyphenols;microwave-hot water extraction;orthogonal optimization;pH stability

余甘子（Phyllanthus emblica L.）系大戟科的中小型落葉喬木，果實呈球形，淺綠色，光滑而堅硬[1]，主要生長在熱帶、亞熱帶地區(qū)，印度和中國的產(chǎn)量最高[2]。余甘子營養(yǎng)豐富，含有對人體有益的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化和清除自由基的能力，被稱為三大高營養(yǎng)水果之一[3]。余甘子產(chǎn)量大，僅少量用來制藥[4]或加工成果凍[5]和果酒[6]等，其余大多并未得到合理的利用。若將余甘子加工成飲料既有利于余甘子資源的合理開發(fā)，還能豐富余甘子產(chǎn)品的多樣性。目前關(guān)于余甘子飲料的研究則主要集中在其出汁率[7]、穩(wěn)定性[8]、功能性[9]和飲料復配[10]等方面，尚未見浸提工藝對余甘子飲料中多酚影響的報道。

多酚傳統(tǒng)的浸提主要采用熱水浸提法[3]，該方法存在耗時長、溶劑用量大、提取效率低的缺點。近年來，微波輔助浸提作為一種高新技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，其原理是利用微波場的偶極旋轉(zhuǎn)導致溶劑溫度迅速上升，化合物的溶解度增加，從而浸提出食品材料壁內(nèi)的結(jié)合物，具有選擇性、高效性和穩(wěn)定性的特點[11-12]，目前已在杏仁黃酮[13]、植物酚類物質(zhì)[14]、西紅柿酚類物質(zhì)[15]的提取中成功應(yīng)用，但在余甘子多酚提取方面少有報道。飲料在加工過程中常常涉及酸堿度的調(diào)節(jié)，這將影響飲料的口感和消費者的接受度，同時也會影響余甘子多酚的含量。為了使余甘子多酚在飲料加工中得到最大限度的保留，需要研究在余甘子浸提過程中多酚含量和種類的變化。本研究采用微波-熱水浸提工藝優(yōu)化余甘子多酚的提取，研究不同pH對提取液酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響，以期為余甘子飲料的生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)，促進余甘子飲料的生產(chǎn)，增加余甘子產(chǎn)品的多樣性。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

余甘子購自涼山州鹽源縣金河鄉(xiāng)。1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）購自源葉生物公司;2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）購自都萊生物公司;槲皮素、綠原酸、山奈酚、柯里拉京、沒食子酸、訶黎勒酸、蘆丁標準品購自上海安譜實驗科技股份有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，亞硝酸鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、沒食子酸等均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2試驗儀器與設(shè)備

微波科學實驗爐（ORW08S-3H）購自南京澳潤微波科技有限公司，高效液相色譜（LC-20AD）購自日本島津公司，全波段酶標儀（3001-2207）購自賽默飛世爾科技有限公司，九陽料理機（JYL-C022E）購自九陽股份有限公司，電熱恒溫水浴鍋（DZKW-5-4）購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3單因素試驗

按一定料液比稱取余甘子鮮果，與純凈水勻漿后置于微波中處理一定時間，然后在固定溫度的水浴鍋中浸提一定時間取出過濾備用。設(shè)定料液比（質(zhì)量體積比）為：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸提時間為：2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，浸提溫度為：30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，微波處理時間為：1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，微波功率為：160 W、320 W、480 W、640 W、800 W。

1.4指標的測定

總酚的測定參考郭炳春[16]的方法，以沒食子酸（GAE）當量表示，黃酮的測定參考Saini等[17]的方法，以蘆?。≧E）當量表示。DPPH自由基清除能力的測定參考Ibrahim等[18]的方法，F(xiàn)RAP鐵還原能力的測定參考Aljadi等[19]的方法，均以抗壞血酸（Vc）當量表示。單酚組分的測定參考NY/T 2795-2015《蘋果中主要酚類物質(zhì)的測定 高效液相色譜法》[20]的方法。色譜柱：Ultimate Plus-C18，4.6 mm×50.0 mm，粒徑5 μm;流動相：A為0.2%的磷酸水溶液;B為乙腈，使用前用0.22 μm濾膜過濾，脫氣。采用梯度洗脫的方式，流動相比例（體積比）隨時間變化如表1所示，檢測波長和柱溫分別設(shè)定為270 nm和25 ℃，進樣量5 μl。

1.5統(tǒng)計分析

采用Excel、SPSS進行數(shù)據(jù)處理，方差分析（ANOVA）通過SPSS 20.0.0完成，采用Duncans多元回歸方法進行相關(guān)性分析，運用Origin 8.5作圖。試驗重復3次，以均值±標準差表示。

2結(jié)果與分析

2.1料液比對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響

料液比是影響植物基質(zhì)中多酚物質(zhì)溶出的重要因素，最大限度地減少溶劑的利用并使產(chǎn)量最大化是工業(yè)生產(chǎn)過程中的一個重要因素[21]。在浸提溫度50 ℃、浸提時間6 min、微波功率480 W和微波處理時間2 min條件下，探討不同料液比對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響。由圖1可知，總酚提取量、DPPH自由基清除能力和FRAP鐵還原能力均隨著料液比的增加先上升后下降，在料液比為1∶20（質(zhì)量體積比）時達到各自最大值，且均顯著高于其他各個水平（P<0.05）。黃酮提取量表現(xiàn)出相似的趨勢，在料液比1∶25（質(zhì)量體積比）時達到最大值，但與料液比1∶20（質(zhì)量體積比）時差異不顯著（P>0.05）?？拙S寶等[22]利用微波輔助提取油橄欖果渣多酚的結(jié)果表明，1∶20（質(zhì)量體積比）為最佳料液比，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)Alara等[23]的研究結(jié)果，過高的溶劑與固體比率可能導致能量不足，無法促進細胞壁的破裂，無法將酚類化合物有效浸出，另外料液比增加需要擴散和溶解的驅(qū)動力增加[24]。綜合考慮，選取料液比1∶15、1∶20、1∶25（質(zhì)量體積比）進行正交優(yōu)化。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.2浸提時間對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響

在浸提溫度50 ℃、微波功率480 W、微波處理時間2 min和料液比1∶20（質(zhì)量體積比）條件下，探討不同浸提時間對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響。由圖2可知，浸提時間對總酚提取量、黃酮提取量、DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力有一定的影響。隨著浸提時間的延長，總酚提取量、黃酮提取量、DPPH自由基清除能力和FRAP鐵還原能力均呈上升趨勢，總酚和黃酮提取量在6 min時達到最大值，而DPPH自由基清除能力和FRAP鐵還原能力在8 min時達到最大值，隨著浸提時間的進一步延長，總酚提取量、黃酮提取量和DPPH自由基清除能力均趨于平緩，而FRAP鐵還原能力在10 min時出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。綜合考慮，其隨著浸提時間的延長，至6 min時，多酚提取量及其抗氧化活性基本達到最大，且考慮到實際應(yīng)用，故不對浸提時間進行進一步優(yōu)化，選取浸提時間6 min為最佳浸提時間。

2.3浸提溫度對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響

在浸提時間6 min、微波功率480 W、微波處理時間2 min和料液比1∶20（質(zhì)量體積比）條件下，探討不同浸提溫度對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響。提高溫度可以增強溶劑向植物樣品內(nèi)部的移動，從而提高提取物的提取率?；趷垡蛩固狗匠?，溶劑黏度隨溫度升高而下降，導致高的擴散速率[25]。如圖3所示，隨著溫度的升高，多酚提取量及其抗氧化活性均呈先上升后下降的趨勢，總酚提取量及DPPH自由基清除能力均在40 ℃時達到最大值，顯著高于其他水平（P<0.05），黃酮提取量及FRAP鐵還原能力在40～70 ℃時有所下降，但下降不顯著（P>0.05），這可能是較高的溫度導致總酚的降解[21]，而黃酮的熱穩(wěn)定性較好，40 ℃已經(jīng)完全溶出，增加溫度不會造成黃酮的分解。綜合考慮，選取浸提溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃進行正交優(yōu)化。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4微波處理時間對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響

在浸提時間6 min、微波功率480 W、浸提溫度40 ℃和料液比1∶20（質(zhì)量體積比）條件下，探討不同微波處理時間對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響。隨著微波處理時間的延長，多酚提取量及其抗氧化活性均呈先上升后下降的趨勢，各指標均在微波處理時間3 min時達到最大（圖4）。根據(jù)Veggip等[26]的描述，微波提取過程分為3個不同的步驟：平衡階段，主要為溶解和分配現(xiàn)象;擴散階段，對流和擴散傳質(zhì)占優(yōu)勢;最后階段，萃取速率較低，溶質(zhì)必須克服與基體的相互作用擴散到萃取溶劑中。提取期間植物細胞吸收微波能量后破裂，有效成分流出溶解在溶劑中，從而提高了酚類物質(zhì)提取量，繼續(xù)延長微波處理時間，酚類化合物在微波場中暴露時間過長，發(fā)生降解[27]，因此隨著微波處理時間的延長，各指標均顯著下降（P<0.05）。Ruth等[28]在木芙蓉花萼總酚提取的研究報告中指出，3 min是最佳的微波處理時間，與本研究結(jié)果一致。綜合考慮，選取微波處理時間2 min、3 min、4 min進行正交優(yōu)化。

2.5微波功率對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響

在浸提時間6 min、微波處理時間3 min、浸提溫度40 ℃和料液比1∶2（質(zhì)量體積比）條件下，探討不同微波功率對余甘子多酚提取及其抗氧化活性的影響。結(jié)果（圖5）表明，隨著微波功率的增加，多酚提取量及其抗氧化活性均呈現(xiàn)上升趨勢，且均在640 W時達到最大值，繼續(xù)增加微波功率，總酚提取量、DPPH自由基清除能力趨于平緩，黃酮提取量與FRAP鐵還原能力略微下降。綜合考慮，選擇微波功率480 W、640 W、800 W進行正交優(yōu)化。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.6正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比（1∶15、1∶20、1∶25，質(zhì)量體積比）、微波功率（480 W、640 W、800 W）、微波處理時間（2 min、3 min、4 min）和浸提溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃）4個主要影響因素在浸提時間6 min條件下進行L9（34）正交優(yōu)化。試驗水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

由表3可知，對于總酚提取量和DPPH自由基清除能力來說，最佳的工藝條件為：A2B2C2D3，即微波功率640 W、微波處理時間3 min、料液比1∶20（質(zhì)量體積比）、浸提溫度50 ℃;就黃酮提取量和FRAP鐵還原能力而言，最佳工藝條件為微波功率640 W、微波處理時間3 min、料液比1∶25（質(zhì)量體積比）、浸提溫度50 ℃。因料液比對黃酮提取量的影響較小，選擇1∶20（質(zhì)量體積比）為最佳的料液比。極差分析結(jié)果表明，各因素對余甘子多酚物質(zhì)提取及其抗氧化活性的影響存在差異，料液比對總酚提取量影響最大;溫度對黃酮提取量、DPPH自由基清除能力、FRAP鐵還原能力影響最大。以上結(jié)果表明，在微波-熱水浸提過程中應(yīng)該嚴格控制料液比及浸提溫度。綜合考慮，最佳的工藝條件為：在料液比為1∶20（質(zhì)量體積比），微波功率640 W條件下微波處理時間3 min后在50 ℃下浸提6 min。

A：料液比;B：微波功率;C：微波處理時間;D：浸提溫度。

2.7驗證試驗

將最佳組合進行驗證試驗且將最佳料液比、浸提溫度、浸提時間用于傳統(tǒng)的熱水浸提中，得到微波-熱水浸提的總酚提取量為49.93 mg/g，黃酮提取量為54.66 mg/g，DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力分別為99.62 mg/g、93.47 mg/g，均高于正交優(yōu)化試驗各組合，比使用傳統(tǒng)熱水浸提的總酚提取量、黃酮提取量、DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力分別提高了50.26%、21.41%、38.36%、18.38%，表明使用微波前處理可以大大地促進酚類物質(zhì)溶入溶劑中。

2.8多酚與抗氧化活性的相關(guān)性分析

為進一步分析余甘子提取液中多酚含量與抗氧化活性之間的關(guān)系，將總酚含量、黃酮含量、DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力進行相關(guān)性分析，其決定系數(shù)（R2）見表4。

由表4可知，總酚含量與DPPH自由基清除能力（R2=0.815）、FRAP鐵還原能力（R2=0.551）之間均極顯著相關(guān)（P<0.01），與總酚含量相關(guān)性強弱為DPPH自由基清除能力>FRAP鐵還原能力;黃酮含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)性（R2=0.837）大于與FRAP鐵還原能力（R2=0.742）的相關(guān)性。由此說明余甘子的抗氧化活性主要與總酚和黃酮含量有關(guān)，與陳冠林等[29]、孫丹等[30]的結(jié)論一致，多酚物質(zhì)在DPPH自由基清除、FRAP鐵還原能力中起著重要的作用。

A：料液比，A1、A2、A3分別表示料液比為1∶15、1∶20、1∶25（質(zhì)量體積比）;B：微波功率，B1、B2、B3分別表示微波功率為480 W、640 W、800 W;C：微波處理時間，C1、C2、C3分別表示微波處理時間為2 min、3 min、4 min;D：浸提溫度，D1、D2、D3分別表示浸提溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃。

1.000**表示極顯著相關(guān)（P<0.01）;*表示顯著相關(guān)（P<0.05）。

2.9pH對余甘子提取液穩(wěn)定性的影響

對余甘子提取液進行pH值調(diào)節(jié)，探究不同pH值對余甘子提取液酚類物質(zhì)含量的影響（圖6）。黃酮含量在不同pH下差異不顯著（P>0.05），總酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP鐵還原能力隨著pH的升高呈先增加后降低的趨勢，其中DPPH自由基清除能力在pH為4時達到最大值，總酚含量和FRAP鐵還原能力在pH為 5時達到最大值，且pH對FRAP鐵還原能力影響較大，pH 為5時FRAP鐵還原能力顯著高于其他pH值時FRAP鐵還原能力（P<0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

對余甘子中常見的多酚物質(zhì)進行HPLC分析，混合標準品的出峰時間如圖7所示。各種多酚物質(zhì)在不同pH條件下的含量見表5。沒食子酸、柯里拉京含量隨著pH的升高呈先上升后下降的趨勢，均在pH=4時達到最大值，繼續(xù)增加pH，含量下降，至pH為7時沒有檢出，這是因為沒食子酸、柯里拉京在酸性條件下較穩(wěn)定，在中性及堿性條件下易降解，吳雪釵等[31]研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在pH值為7～10時降解迅速，3 h已完全降解;綠原酸含量隨著pH的升高迅速下降，當pH為7時，余甘子提取液中未檢出綠原酸，表明綠原酸對酸堿的敏感性較強，這可能與綠原酸在pH逐漸升高的過程中堿催化水解有關(guān)[32];蘆丁含量在pH為4時含量最高，顯著高于其他pH時的含量（P<0.05）;鞣花酸含量隨著pH的增加而逐漸增加，在pH為7時含量最高，顯著高于其他pH時的含量（P<0.05），說明在中性條件下，鞣花酸更加穩(wěn)定;槲皮素含量在pH 3～6時均比較穩(wěn)定，而在pH為7時顯著降低（P<0.05）;訶黎勒酸含量隨pH的增加先上升后下降，pH為6時，訶黎勒酸含量最高（P<0.05），說明其在弱酸及中性條件下較為穩(wěn)定。山奈酚在各個pH條件下均未檢出。

1：tR（出峰時間）=4.287，沒食子酸;2：tR=12.103，綠原酸;3：tR=13.512，柯里拉京;4：tR=16.050，蘆丁;5：tR=16.362，鞣花酸;6：tR=16.789，訶黎勒酸;7：tR=22.127，槲皮素;8：tR=23.954，山奈酚。

3討論

余甘子含水量少、難以用壓榨法提取，因此采用浸提法提取，該過程影響原料活性物質(zhì)提取率和飲料品質(zhì)，是整個果汁制作過程中關(guān)鍵的一步。微波輻射屬熱輻射，因現(xiàn)有植物生物活性化學物質(zhì)的多樣性，不同植物的細胞組織對微波吸收能力不同，可能無法針對所有植物材料進行概括，因此必須根據(jù)所使用的基質(zhì)來選擇和優(yōu)化加工條件[33]。崔蕊靜等[34]采用微波預處理-熱水浸提安梨皮渣中多酚類物質(zhì)，結(jié)果表明微波輔助浸提可以顯著提高提取率，縮短提取時間且不會對酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。ND表示未檢出。

本試驗采用微波-熱水浸提新技術(shù)提取余甘子多酚，并對其抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明該方法比傳統(tǒng)的熱水提取總酚含量、黃酮含量、DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力分別提高了50.26%、21.41%、38.36%、18.38%。該工藝的優(yōu)勢在于采用短時的微波處理破裂余甘子果肉細胞，通過熱水浸提促進余甘子酚類物質(zhì)溶解從而提高提取率，為余甘子飲料的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)于果實的抗氧化能力與果實中的活性物質(zhì)的相關(guān)性，前人已有較多的研究。多數(shù)研究結(jié)果表明水果中酚類物質(zhì)與水果的抗氧化活性有一定的相關(guān)性[35-37]。劉文旭等[38]研究結(jié)果表明總抗氧化能力與其總酚含量、黃酮含量存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。高帆等[39]研究結(jié)果表明5種甜櫻桃的總酚含量和黃酮含量與抗氧化活性顯著相關(guān)。本研究對余甘子提取液中的總酚含量、黃酮含量與DPPH自由基清除能力、FRAP鐵還原能力進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明酚類物質(zhì)與抗氧化能力之間有顯著相關(guān)性，且總酚含量對DPPH自由基清除能力的影響最大。以上結(jié)果表明余甘子具有很好的保健價值，可作為功能性食品的良好資源。

本研究結(jié)果表明，不同pH對余甘子提取液的總酚含量的影響顯著，對黃酮含量的影響不顯著;隨著pH的升高，DPPH自由基清除能力及FRAP鐵還原能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，pH可使多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其抗氧化活性及對自由基的清除作用[40]。結(jié)果表明，余甘子飲料適合酸性條件生產(chǎn)，此時活性成分最高，抗氧化能力最佳。

多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性主要是取決于其獨特的化學結(jié)構(gòu)。沒食子酸、柯里拉京及綠原酸在酸性條件下含量較高，鞣花酸、訶黎勒酸在中性條件下含量較高，蘆丁則在弱酸條件下較穩(wěn)定，槲皮素在各個pH條件下含量無顯著變化（P<0.05）。

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（責任編輯：陳海霞）